Probioottien vaikutukset perifeeriseen immuniteettiin Parkinsonin taudissa

Johdanto Parkinsonin tauti (PD) on yleinen hermostoa rappeuttava sairaus, jota sairastaa enintään 1-2 ihmistä 1000:sta kerrallaan. Esiintyminen lisääntyy iän myötä ja sen arvioidaan olevan 1 % yli 65-vuotiaista.

Ei ole saatavilla hoitoa PD:n puhkeamisen estämiseksi tai sen etenemisen hidastamiseksi, ja hoito keskittyy oireiden hallintaan. Karbidopan/levodopan antaminen mahdollistaa motoristen oireiden hallinnan, mutta sen teho heikkenee taudin edetessä ja päivittäisten annosten lisääminen aiheuttaa useammin ja vakavampia sivuvaikutuksia.

PD:n histopatologinen tunnusmerkki on dopaminergisten hermosolujen häviäminen ja α-synukleiinin (α-syn) kerääntyminen eloonjääneisiin hermosoluihin, mutta taustalla oleva patofysiologia on edelleen epäselvä. Tulehdusmekanismeilla on ehdotettu olevan merkittävä rooli taudissa, ja haitallisten ja suojaavien immuunitoimintojen välillä on epätasapaino sekä reaktiivisten happilajien (ROS) aiheuttama neurotoksisuus.

Lisätodisteet korostavat perifeerisen adaptiivisen immuniteetin osallisuutta PD:ssä, raportoivat epätasapainosta T-solualapopulaatioissa ja transkriptiotekijöiden ilmentymisessä CD4+ T-soluissa PD-potilailla.

Näillä potilailla ei-motoriset oireet voivat edeltää kliinisesti todetun taudin puhkeamista.

PD:n etiopatogeneesi on edelleen tuntematon, mutta Braakin et al. oletti α-syn:n aggregaation alun perin suolistossa, minkä jälkeen se levisi vagushermoa pitkin aivoihin ja lopulta saavuttaa mustasubstan mesencephalonissa.

Mielenkiintoista on, että PD:n α-syn-yliekspressoivassa hiiren mallissa suoliston mikrobiotan puuttuminen esti sekä mikroglia-aktivaation että motorisen heikkenemisen, mikä viittaa suolen ja mikrobiotan perustavanlaatuiseen rooliin PD:n patogeneesissä ja kehityksessä.

Tuoreessa artikkelissa Magistrelli et ai. vahvisti, että probiootit voivat vaikuttaa perifeeriseen immuunijärjestelmään. Erityisesti PD-potilaiden kohortin perifeerisen veren mononukleaarisoluissa (PMBC:t) probiootit pystyivät moduloimaan sytokiinien tuotantoa kohti tulehdusta estävää profiilia ja vähentämään reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa. Probioottien kliinisiä vaikutuksia on tutkittu myös muissa patologisissa tiloissa. Tankou et ai. annettiin VSL#3:a yhdeksän multippeliskleroosipotilaan kohortille, joiden perifeerinen immuunijärjestelmä siirtyi kohti anti-inflammatorista profiilia, käänteisellä taipumuksella VSL#3:n lopettamisen jälkeen. Sama ryhmä vahvisti nämä tulokset myös probioottien (neljä Lactobacillus-kantaa ja kolme Bifidobacterium-kantaa) antamisen jälkeen.

Näiden todisteiden valossa tutkijat suunnittelivat satunnaistetun kontrolloidun kliinisen tutkimuksen, jonka ensisijaisena tavoitteena on testata, voivatko probiootit vaikuttaa perifeeriseen immuunijärjestelmään PD-potilaiden kohortissa. Protokollan tavoitteena on tuoda esiin muutoksia transkriptiotekijöiden lähetti-ribonukleiinihapon (mRNA) tasoissa, lymfosyyttien alapopulaatioissa (Th1, Th2, Th17 ja Treg), sytokiinitasoissa ja ROS-tuotannossa.

Menetelmät ja analyysit Tämä eksploatiivinen tutkimus on satunnaistettu lumekontrolloitu kaksoissokkotutkimus probioottien tehokkuuden arvioimiseksi perifeerisen immuunijärjestelmän moduloinnissa Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla. Osallistujat satunnaistetaan kahteen vertailukelpoiseen ryhmään ja niitä hoidetaan probioottien tai vastaavan lumelääkkeen seoksella kerran päivässä kolmen kuukauden ajan. Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on varmistaa probioottien vaikutukset perifeeriseen immuunijärjestelmään. Tutkimustuloksina seurataan PD:n motorisia ja ei-motorisia oireita sekä kognitiivisia toimintoja ja elämänlaatua kolmen kuukauden hoitojakson aikana kliinisen luokitusasteikon avulla.

Osallistujien tunnistaminen Koehenkilöt rekrytoidaan potilaiden joukosta, joilla on säännölliset rutiininomaiset seurantakäynnit Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novarassa. Yksityiskohtaiset tiedot liitännäissairauksista, nykyisestä lääkehoidosta ja näiden koehenkilöiden demografisista tiedoista ovat helposti saatavilla. Kokeilusuunnitelma hahmotellaan lyhyesti ja potilailta kysytään heidän kiinnostuksensa osallistua. Halukkaat osallistuvat seulontakäynnille, kirjallinen tietoinen suostumus hankitaan ennen kelpoisuuden vahvistamista.

Kokeilumenettelyt

Kliininen Ilmoittautumiskäynnin aikana lääketieteellinen ja neurologinen tutkimus arvioi välittömien muutosten tarpeen lääketieteellisessä terapiassa jokaisen osallistujan osalta. Kahden viikon kuluessa kaikki hoidon muutokset tehdään päätökseen ja lähtötilannekäynti ajoitetaan.

Perustilan käynnin (T0) aikana fyysiset ja neurologiset tutkimukset toistetaan potilaan tilan ja sisällyttämiskriteerien pysyvyyden vahvistamiseksi, suoritetaan perusverenotto ja kaikki kliiniset arviointiasteikot täytetään peruspisteiden määrittämiseksi. Jokainen osallistuja satunnaistetaan asianmukaisen tietoon perustuvan suostumuksen tilauksen jälkeen, ja hänelle annetaan hoitolaatikko, joka sisältää kerta-annospusseja, joissa on 2,7 g jauhetta määrättyä koostumusta. Potilaita ohjeistetaan ottamaan päiväannokset kotona joka aamu ennen aamiaista sekoittamalla yhden pussin sisältö noin 125 ml:aan makeaa vettä tai muuta kylmää hiilihapotonta juomaa. Osallistujia neuvotaan säilyttämään käyttämättömät tai tyhjät pakkaukset muistelua ja vaatimustenmukaisuuden arviointia varten.

Seurantakäynnit ajoitetaan 4 viikkoa T0:n jälkeen (T1) ja 12 viikkoa T0:n jälkeen (T2). T1:ssä fyysinen ja neurologinen tutkimus toistetaan ja kaikki kliiniset asteikot annetaan uudelleen. T2:ssa kaikki T0:ssa tehdyt arvioinnit suoritetaan uudelleen, mukaan lukien verenotto.

Aikana T0 ja T2 otetaan 40 ml laskimoverta paastoyön jälkeen klo 8.00-10.00 etyleenidiamiinitetraetikkahapolla päällystetyissä putkissa (BD Vacutainer). Putket koodataan ja niitä säilytetään huoneenlämmössä käsittelyyn asti 24 tunnin sisällä. Täydellinen verenkuva erotusanalyysillä tehdään erillisistä verinäytteistä.

Laboratoriomenetelmät

Sytokiinien mittaus Probioottihoidon mahdollista vaikutusta tulehdusprofiiliin arvioidaan mittaamalla plasman pro- (esim. Tuumorinekroositekijä (TNF)-α, interferoni (IFN)-y) ja anti-inflammatoriset sytokiinit (interleukiini (IL)-10, IL-4). Jokaisesta näytteestä erotetaan plasmaeriä ja säilytetään sytokiinimäärityksiä varten. 2 ml tuoretta verta sentrifugoidaan 1 400 g:ssä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja kaksi 350 µl:n plasma-eriä säilytetään 1,5 ml:n pulloissa sytokiinitasojen määrittämiseksi.

Immuunifenotyypin virtaussytometrinen arviointi Immuunifenotyypin mahdollisten muutosten selvittämiseksi sytofluorimetrisen arvioinnin avulla sytofluorimetrisen arvioinnin avulla syvennetaan sekä synnynnäisen että adaptiivisen immuniteetin profiilia Kustrimovic et al. kuvaaman strategian mukaisesti. vuonna 2018 ja lisäpaneeleilla, jotka on erityisesti omistettu synnynnäiselle immuniteetille. Seuraavat adaptiivisen immuunijärjestelmän solualaryhmät arvioidaan: CD4+- ja CD8+-T-naiivit/muistisolut, CD4+-T-auttaja-alajoukot ja CD4+-säätely-T-solut. Lisäksi luontaisen immuniteetin osalta arvioidaan myös monosyytit ja Natural Killer (NK) -solut. Hankinta suoritetaan BD-fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS) Celesta-virtaussytometrillä (Becton Dickinson Italia, Milano, Italia) BD FACS Diva -ohjelmistolla (versio 8.0.1.1) ja tiedot analysoidaan FlowJo-ohjelmistolla (versio 10.7.1)

Transkriptiotekijöiden mRNA-arviointi Kustrimovicin ja De Francescon aikaisempien tutkimusten mukaan myös probioottihoidon kykyä muokata tärkeimpien transkriptiotekijöiden mRNA-tasoja CD4+ T-lymfosyyteissä tutkitaan. CD4+-positiiviset solut saadaan PBMC:llä, joka eristetään kokoverestä käyttämällä Ficoll-Paque Plus -tiheysgradienttisentrifugointia. Uudelleensuspendoinnin jälkeen jäljellä olevat kontaminoivat erytrosyytit hajotetaan lisäämällä 10 ml lyysipuskuria ((g/l) NH4Cl 8,248, KHC03 1,0, EDTA 0,0368). Solut pestään kahdesti puhdistetussa naudan seerumissa (PBS) lisäämällä 10 ml PBS:ää, sitten sentrifugoidaan 300 g:lla 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja suspendoidaan uudelleen 10 ml:aan Roswell Park Memorial Institute -alustaa (RPMI) / 10 % Fetal Bovine Seerumi (FBS). Sen jälkeen suoritetaan manuaalinen solujen määrä CD4-erotusreagenssien määrittämiseksi.

Tyypilliset PBMC-valmisteet sisältävät vähintään 80 % lymfosyyttejä. CD4+ T-solut eristetään sitten PBMC:stä Dynabeads CD4 Positive Isolation -sarjan avulla. Vähintään 50 000 erotettua CD4+ T-solua suspendoidaan sitten uudelleen PerfectPure RNA -lyysipuskuriin (5 Prime GmbH, Hampuri, Saksa), ja kokonais-RNA uutetaan PerfectPure RNA Cell Kit™ -sovelluksella.

Tuloksena olevalle mRNA:lle suoritetaan käänteistranskriptio käyttämällä satunnaista aluketta ja suuren kapasiteetin komplementaarista DNA:ta (cDNA) Real Time (RT) -kittiä.

RT-polymeraasiketjureaktiot (PCR) suoritetaan 1 µM cDNA:lla. cDNA:n monistaminen mahdollistaa transkriptiotekijägeenien TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 ja NR4A2 mRNA-tasojen analysoinnin.

Hoidon koostumus ja perustelut

Hoito:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 pesäkettä muodostavaa yksikköä (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Frukto-oligosakkarideja FOS 250 mgqsto 250.

Plasebo:

Maltodekstriini q.s.

Jokainen probioottiformulaatio sisältää Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) ja Bifidobacterium adolescentis (BA02). Frukto-oligosakkarideja (FOS) lisätään prebioottisena komponenttina ja maltodekstriiniä käytetään täyteaineena.

Probioottien valinta tähän tutkimukseen perustuu vankkaan kirjallisuustietoon: erityisesti Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) osoitti lisääntynyttä anti-inflammatorisen sytokiinin IL-10:n tuotantoa. Mainittu käsittely tuki myös kalvon eheyden palauttamista Cac02-solujen mallissa.

Kaikki käytetyt probiootit sisältyvät "Quality Presumption of Safety (QPS) -suosituksiin, elintarvikkeisiin tai rehuihin tarkoituksellisesti lisättyihin biologisiin tekijöihin, jotka on ilmoitettu Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaiselle (EFSA) 12".

Plaseboformulaatio koostuu yksinomaan maltodekstriinistä.

Otoskoon laskenta, data-analyysi Tämän tutkimuksen suunnittelu on eksploatiivinen ja yhtä lailla satunnaistettu probiootti- tai lumelääkehoitoon. Koska ehdotettu tutkimus on luonteeltaan tutkiva, muodollista otoskoon laskemista ei ehdottomasti vaadita. Tämän tutkimuksen näytteen koko on siis perustunut pääasiassa aikaisempiin tuloksiin toisesta in vitro -tutkimuksesta, joka tuotti tilastollisesti merkitseviä tuloksia pienessä 40 PD-potilaan kohortissa kaikkien testattujen probioottikantojen osalta, ja proinflammatoristen sytokiinien tuotanto väheni maailmanlaajuisesti ja lisääntyi anti-inflammatoriset sytokiinit. Tässä tutkimuksessa odotettu näyte kaksinkertaistuu, ja yhteensä 80 näytettä kerätään sekä T0:ssa että T2:ssa.

Aiemman in vitro -tutkimuksen tietoja on käytetty kaikkien testattujen probioottisten kantojen in vitro -vaikutusten suuntautuvien näytteiden kokojen arvioimiseen, ja 80 kohteen otoskoko mahdollistaa useimpien testattujen sytokiinien vaihteluiden määrittämisen odotetulla teholla yli 80 %. tilastollisen merkitsevyyden kynnys on 0,05.

Kerätyn datan tilastollinen analyysi suoritetaan sen jälkeen, kun on arvioitu tietojen jakauman normaalisuus ja käytetty kaksisuuntaista Studentin t-testiä tai Mann-Whitney-testiä riippumattomien muuttujien vertailuun soveltuvin osin. Tietojen korrelaatiot analysoidaan Pearsonin tai Spearmanin korrelaatiotesteillä. ANOVA- tai Kruskal-Wallis-testejä käytetään useamman kuin kahden ryhmän vertailuun ja parillisten ryhmien vertailussa käytetään paritettua t-testiä tai Wilcoxon-merkittyä ranking-testiä (esim. lähtötaso vs hoidon loppu, hoito vs lumelääke). Tilastollisen merkitsevyyden kynnysarvot asetetaan erityisten testiominaisuuksien mukaan.