Effecten van probiotica op perifere immuniteit bij de ziekte van Parkinson

Inleiding De ziekte van Parkinson (PD) is een veelvoorkomende neurodegeneratieve ziekte die op elk moment tot 1-2 mensen op de 1000 treft. De prevalentie neemt toe met de leeftijd en wordt geschat op 1% bij 65-plussers.

Er is geen behandeling beschikbaar om het begin van de ziekte van Parkinson te voorkomen of de progressie ervan te vertragen en de therapie is gericht op symptoombeheersing. De toediening van carbidopa/levodopa zorgt voor controle van de motorische symptomen, maar wordt minder effectief naarmate de ziekte voortschrijdt en toenemende dagelijkse doses veroorzaken frequentere en ernstigere bijwerkingen.

Het histopathologische kenmerk van PD is het verlies van dopaminerge neuronen en accumulatie van α-synucleïne (α-syn) in overlevende neuronen, maar de onderliggende pathofysiologie is nog onduidelijk. Er is gesuggereerd dat ontstekingsmechanismen een prominente rol spelen bij de ziekte, met een onbalans tussen schadelijke en beschermende immuunfuncties, evenals neurotoxiciteit veroorzaakt door reactieve zuurstofspecies (ROS).

Verder bewijs wijst op de betrokkenheid van perifere adaptieve immuniteit bij PD, waarbij een onevenwichtigheid in T-celsubpopulaties en in de expressie van transcriptionele factoren in CD4+ T-cellen bij PD-patiënten wordt gemeld.

Bij deze patiënten kunnen niet-motorische symptomen voorafgaan aan het begin van een klinisch vastgestelde ziekte.

Etiopathogenese van PD is nog onbekend, maar baanbrekend werk van Braak et al. veronderstelde een aanvankelijke aggregatie van α-syn in de darm met daaropvolgende voortplanting langs de nervus vagus naar de hersenen, en bereikte uiteindelijk de substantia nigra in het mesencephalon.

Interessant is dat in een α-syn tot overexpressie brengend murien model van PD de afwezigheid van darmmicrobiota zowel microglia-activering als motorische stoornissen verhinderde, wat wijst op een fundamentele rol van de darm en microbiota in de pathogenese en ontwikkeling van PD.

In een recent artikel, Magistrelli et al. bevestigde dat probiotica het perifere immuunsysteem kunnen beïnvloeden. Vooral in perifere mononucleaire bloedcellen (PMBC's) van een cohort van PD-patiënten waren probiotica in staat om de productie van cytokines te moduleren in de richting van een ontstekingsremmend profiel en om de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) te verminderen. De klinische effecten van probiotica zijn ook onderzocht bij andere pathologische aandoeningen. Tankou et al. VSL#3 toegediend in een cohort van 9 multiple sclerosepatiënten, van wie het perifere immuunsysteem verschoof naar een ontstekingsremmend profiel, met een omgekeerde tendens na stopzetting van VSL#3. Deze resultaten werden ook door dezelfde groep bevestigd na toediening van een mix van probiotica (vier stammen van Lactobacillus en drie stammen van Bifidobacterium).

In het licht van dit bewijs ontwierpen de onderzoekers een gerandomiseerde gecontroleerde klinische studie met als hoofddoel te testen of probiotica het perifere immuunsysteem kunnen beïnvloeden in een cohort van PD-patiënten. Het doel van het protocol is om veranderingen in transcriptionele factoren messenger Ribonucleic Acid (mRNA) niveaus, lymfocyten subpopulaties (Th1, Th2, Th17 en Treg), cytokine niveaus en ROS-productie te markeren.

Methoden en analyses Deze verkennende studie is een gerandomiseerde, placebogecontroleerde, dubbelblinde studie om de werkzaamheid van probiotica te evalueren bij het moduleren van het perifere immuunsysteem bij patiënten met de ziekte van Parkinson. Deelnemers worden gerandomiseerd in twee vergelijkbare groepen en gedurende drie maanden eenmaal daags behandeld met een mengsel van probiotica of een bijpassende placebo. Het primaire doel van deze studie is om de effecten van probiotica op het perifere immuunsysteem te verifiëren. Als verkennende uitkomsten zullen motorische en niet-motorische symptomen van de ziekte van Parkinson worden gevolgd, evenals de cognitieve functie en kwaliteit van leven gedurende de behandelingsperiode van drie maanden via een selectie van klinische beoordelingsschalen.

Identificatie van de deelnemer Proefpersonen zullen worden geworven onder patiënten met geplande routinematige vervolgbezoeken bij Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Gedetailleerde informatie over comorbiditeit, huidige medische therapie en demografische gegevens van deze proefpersonen zal direct beschikbaar zijn. Het proefontwerp zal kort worden geschetst en patiënten zullen worden gevraagd naar hun interesse in deelname. Bereidwillige proefpersonen zullen een screeningbezoek bijwonen, schriftelijke geïnformeerde toestemming zal worden verkregen voordat wordt bevestigd dat ze in aanmerking komen.

Proefprocedures

Klinisch Tijdens het inschrijvingsbezoek zal medisch en neurologisch onderzoek de noodzaak van onmiddellijke variaties in medische therapie voor elke deelnemer beoordelen. Binnen twee weken wordt elke therapieaanpassing voltooid en wordt een basisbezoek gepland.

Tijdens het basisbezoek (T0) zullen fysieke en neurologische onderzoeken worden herhaald om de toestand van de proefpersoon en de volharding van de inclusiecriteria te bevestigen, zal een basisbloedafname worden uitgevoerd en zullen alle klinische beoordelingsschalen worden ingevuld om basisscores vast te stellen. Elke deelnemer wordt, na het ondertekenen van een geschikte geïnformeerde toestemming, gerandomiseerd en krijgt een behandelingsdoos met sachets voor eenmalig gebruik met 2,7 g poeder van de toegewezen formulering. Patiënten zullen worden geïnstrueerd om elke ochtend voor het ontbijt dagelijkse doses thuis in te nemen, waarbij de inhoud van één sachet wordt gemengd met ongeveer 125 ml vers water of een andere koude, niet-koolzuurhoudende drank. Deelnemers krijgen de instructie om ongebruikte of lege verpakkingen te bewaren voor herinnering en nalevingsevaluatie.

Vervolgbezoeken worden gepland op 4 weken na T0 (T1) en op 12 weken na T0 (T2). Op T1 wordt lichamelijk en neurologisch onderzoek herhaald en worden alle klinische schalen opnieuw afgenomen. Op T2 worden alle op T0 uitgevoerde onderzoeken opnieuw uitgevoerd, inclusief bloedafname.

Op T0 en T2 wordt na een vastennacht tussen 8:00 en 10:00 uur 40 ml veneus bloed afgenomen in met ethyleendiaminetetraazijnzuur gecoate buisjes (BD Vacutainer). Buizen worden gecodeerd en bij kamertemperatuur bewaard tot verwerking, binnen 24 uur. Een volledig bloedbeeld met differentiële analyse wordt uitgevoerd op afzonderlijke bloedmonsters.

Laboratorium methoden

Cytokinemeting De mogelijke invloed van probiotische behandeling op het ontstekingsprofiel zal geëvalueerd worden door op T0 en T2 de plasmaspiegels van pro (vb. Tumornecrosefactor (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ) en ontstekingsremmende cytokines (Interleukine (IL)-10, IL-4). Plasma-aliquots van elk monster worden gescheiden en opgeslagen voor cytokine-assays. 2 ml vers bloed wordt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 1400 g en twee plasma-aliquots van elk 350 µl worden opgeslagen in flesjes van 1,5 ml om de cytokineniveaus te testen.

Flowcytometrische evaluatie van immuunfenotype Om mogelijke veranderingen in immuunfenotype te onderzoeken, zal het profiel van zowel aangeboren als adaptieve immuniteit worden uitgediept door middel van een cytofluorimetrische evaluatie volgens de strategie beschreven door Kustrimovic et al. in 2018 en met aanvullende panels die specifiek gericht zijn op aangeboren immuniteit. De volgende celsubsets van het adaptieve immuunsysteem zullen worden beoordeeld: CD4+ en CD8+ T naïeve/geheugencellen, CD4+ T helper subsets en CD4+ regulerende T-cellen. Bovendien zullen voor aangeboren immuniteit ook monocyten en Natural Killer (NK)-cellen worden beoordeeld. Acquisitie zal worden uitgevoerd op een BD Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Celesta flowcytometer (Becton Dickinson Italië, Milaan, Italië) met BD FACS Diva-software (versie 8.0.1.1) en gegevens worden geanalyseerd met FlowJo-software (versie 10.7.1)

Transcriptionele factoren mRNA-evaluatie Volgens eerdere studies door Kustrimovic en De Francesco, zal ook het vermogen van probiotische behandeling om mRNA-niveaus van de belangrijkste transcriptionele factoren in CD4+ T-lymfocyten te wijzigen, worden onderzocht. CD4+-positieve cellen zullen worden verkregen door PBMC, die zullen worden geïsoleerd uit volbloed met behulp van Ficoll-Paque Plus dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Na resuspensie zullen resterende verontreinigende erytrocyten worden gelyseerd door toevoeging van 10 ml lysisbuffer ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Cellen worden tweemaal gewassen in Purified Bovine Serum (PBS) door toevoeging van 10 ml PBS, vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd bij 300 g bij kamertemperatuur en opnieuw gesuspendeerd in 10 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/10% foetaal rund Serum (FBS). Handmatige celtelling wordt dan uitgevoerd om de hoeveelheden CD4-scheidingsreagentia in te stellen.

Typische PBMC-preparaten bevatten ten minste 80% lymfocyten. CD4+ T-cellen worden vervolgens geïsoleerd uit PBMC door middel van Dynabeads CD4 Positive Isolation kit. Ten minste 50.000 gescheiden CD4+ T-cellen worden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PerfectPure RNA-lysisbuffer (5 Prime GmbH, Hamburg, Duitsland), en totaal RNA wordt geëxtraheerd door PerfectPure RNA Cell Kit™.

Reverse-transcriptie zal worden uitgevoerd op resulterend mRNA met behulp van een willekeurige primer en een real-time (RT) kit met hoge capaciteit complementair DNA (cDNA).

RT-Polymerase Chain Reactions (PCR) zullen worden uitgevoerd met 1 μM cDNA. Amplificatie van cDNA zal de analyse van mRNA-niveaus van de transcriptiefactorgenen TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 en NR4A2 mogelijk maken.

Samenstelling en motivering van de behandeling

Behandeling:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Colony Forming Units (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fructo-oligosacchariden FOS 2500 mg Maltodextrine q.s.

Placebo:

Maltodextrine q.s.

Elke formulering van probiotica bevat Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) en Bifidobacterium adolescentis (BA02). Fructo-oligosacchariden (FOS) worden toegevoegd als een prebiotische component en maltodextrine wordt gebruikt als vulstof.

De keuze van probiotica voor deze studie is gebaseerd op solide literatuurgegevens: met name PBMC van PD-patiënten behandeld met Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) vertoonde een verhoogde productie van ontstekingsremmend cytokine IL-10. Deze behandeling ondersteunde ook het herstel van de membraanintegriteit in een model van CacO2-cellen.

Alle gebruikte probiotica zijn opgenomen in de "Qualified Presumption of Safety (QPS)-aanbevolen biologische agentia die opzettelijk aan levensmiddelen of diervoeders zijn toegevoegd, zoals aangemeld bij de Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) 12".

De placeboformulering is uitsluitend samengesteld uit maltodextrine.

Berekening van de steekproefomvang, data-analyse De opzet van deze studie is verkennend en evenzeer gerandomiseerd naar behandeling met probiotica of placebo. Vanwege het verkennende karakter van het voorgestelde onderzoek is een formele berekening van de steekproefomvang niet strikt vereist. De steekproefomvang voor deze studie is dus voornamelijk gebaseerd op eerdere resultaten van een andere in vitro studie, die statistisch significante resultaten opleverde in een klein cohort van 40 PD-patiënten voor alle geteste probiotische stammen, met een globale vermindering van pro-inflammatoire cytokineproductie en een toename van ontstekingsremmende cytokines. In de huidige studie zal het verwachte monster worden verdubbeld, met in totaal 80 monsters die zowel op T0 als op T2 moeten worden verzameld.

Gegevens van eerdere in vitro-studies zijn gebruikt om oriëntatiesteekproeven te schatten voor het in vitro effect van alle geteste probiotische stammen en een steekproefomvang van 80 proefpersonen maakt het mogelijk om de meeste geteste cytokinevariaties te bepalen met een verwacht vermogen van meer dan 80%, instelling de drempel voor statistische significantie op 0,05.

Statistische analyse van de verzamelde gegevens zal worden uitgevoerd na beoordeling van de normaliteit van de gegevensverdeling en het gebruik van tweezijdige Student's t-test of Mann-Whitney-test, al naar gelang geschikt voor vergelijkingen van onafhankelijke variabelen. Gegevenscorrelaties zullen worden geanalyseerd door middel van Pearson's of Spearman's correlatietests. ANOVA of de Kruskal-Wallis-tests zullen worden gebruikt voor vergelijkingen tussen meer dan twee groepen en gepaarde t-test of Wilcoxon ondertekende rangen-test zullen worden gebruikt bij het vergelijken van gepaarde groepen (bijv. baseline versus einde van de behandeling, behandeling versus placebo). Drempels voor statistische significantie zullen worden vastgesteld op basis van de specifieke testkenmerken.