Účinky probiotik na periferní imunitu u Parkinsonovy choroby

Úvod Parkinsonova nemoc (PD) je běžné neurodegenerativní onemocnění, které postihuje až 1–2 osoby z 1000 v kteroukoli danou dobu. Prevalence se zvyšuje s věkem a odhaduje se na 1 % u lidí starších 65 let.

Neexistuje žádná dostupná léčba, která by zabránila vzniku PD nebo oddálila její progresi a terapie je zaměřena na zvládání symptomů. Podávání karbidopy/levodopy umožňuje kontrolu motorických symptomů, ale s progresí onemocnění se stává méně účinným a zvyšující se denní dávky způsobují častější a závažnější vedlejší účinky.

Histopatologickým znakem PD je ztráta dopaminergních neuronů a akumulace α-synukleinu (α-syn) v přežívajících neuronech, ale základní patofyziologie je stále nejasná. Předpokládá se, že v onemocnění hrají významnou roli zánětlivé mechanismy s nerovnováhou mezi škodlivými a ochrannými imunitními funkcemi a také neurotoxicitou způsobenou reaktivními formami kyslíku (ROS).

Další důkazy zdůrazňují zapojení periferní adaptivní imunity u PD, uvádějící nerovnováhu v subpopulacích T buněk a v expresi transkripčních faktorů v CD4+ T buňkách u pacientů s PD.

U těchto pacientů mohou nemotorické příznaky předcházet nástupu klinicky zjištěného onemocnění.

Etiopatogeneze PD je stále neznámá, ale klíčová práce Braaka et al. předpokládali počáteční agregaci α-syn ve střevě s následnou propagací podél bloudivého nervu do mozku, až nakonec dosáhl substantia nigra v mezimozku.

Je zajímavé, že v myším modelu PD s nadměrnou expresí α-syn absence střevní mikroflóry zabránila jak aktivaci mikroglií, tak i motorickému poškození, což ukazuje na zásadní roli střeva a mikrobioty v patogenezi a rozvoji PD.

V nedávném článku Magistrelli et al. potvrdili, že probiotika mohou ovlivnit periferní imunitní systém. Zejména v mononukleárních buňkách periferní krve (PMBC) kohorty pacientů s PD byla probiotika schopna modulovat produkci cytokinů směrem k protizánětlivému profilu a snižovat produkci reaktivních forem kyslíku (ROS). Klinické účinky probiotik byly zkoumány i u jiných patologických stavů. Tankou a kol. podávali VSL#3 u kohorty 9 pacientů s roztroušenou sklerózou, jejichž periferní imunitní systém se posunul směrem k protizánětlivému profilu, s inverzní tendencí po vysazení VSL#3. Tyto výsledky také potvrdila stejná skupina po podání mixu probiotik (čtyři kmeny Lactobacillus a tři kmeny Bifidobacterium).

Ve světle těchto důkazů výzkumníci navrhli randomizovanou kontrolovanou klinickou studii, jejímž primárním cílem je otestovat, zda probiotika mohou ovlivnit periferní imunitní systém u kohorty pacientů s PD. Cílem protokolu je upozornit na změny hladin transkripčních faktorů messenger ribonukleové kyseliny (mRNA), subpopulací lymfocytů (Th1, Th2, Th17 a Treg), hladin cytokinů a produkce ROS.

Metody a analýzy Tato explorativní studie je randomizovaná placebem kontrolovaná dvojitě zaslepená studie k vyhodnocení účinnosti probiotik při modulaci periferního imunitního systému u subjektů s Parkinsonovou chorobou. Účastníci budou randomizováni do dvou srovnatelných skupin a léčeni směsí probiotik nebo odpovídajícím placebem jednou denně po dobu tří měsíců. Primárním cílem této studie je ověřit účinky probiotik na periferní imunitní systém. Jako výsledky průzkumu budou monitorovány motorické a nemotorické symptomy PD, stejně jako kognitivní funkce a kvalita života během tříměsíčního léčebného období prostřednictvím výběru klinických hodnoticích škál.

Identifikace účastníků Subjekty budou vybrány mezi pacienty s plánovanými rutinními následnými návštěvami na Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Podrobné informace o komorbiditách, aktuální léčebné terapii a demografické údaje těchto subjektů budou snadno dostupné. Bude stručně nastíněn návrh studie a pacienti budou dotázáni na jejich zájem o účast. Ochotné subjekty se zúčastní screeningové návštěvy, písemný informovaný souhlas bude získán před potvrzením způsobilosti.

Zkušební postupy

Klinické Během návštěvy při zápisu posoudí lékařské a neurologické vyšetření potřebu okamžitých změn v lékařské terapii pro každého účastníka. Do dvou týdnů bude dokončena jakákoli úprava terapie a naplánována základní návštěva.

Během základní návštěvy (TO) budou opakována fyzikální a neurologická vyšetření, aby se potvrdil stav subjektu a přetrvávání kritérií pro zařazení, bude proveden základní odběr krve a budou dokončeny všechny škály klinického hodnocení pro nastavení výchozího skóre. Každý účastník bude po obdržení příslušného informovaného souhlasu randomizován a dostane léčebný box obsahující jednodávkové sáčky s 2,7 g prášku přidělené formulace. Pacienti budou instruováni, aby užívali denní dávky doma každé ráno před snídaní a obsah jednoho sáčku rozmíchali v cca 125 ml sladké vody nebo jiného studeného nesyceného nápoje. Účastníci budou instruováni, aby si ponechali nepoužité nebo prázdné obaly pro účely zpětného odběru a vyhodnocení souladu.

Následné návštěvy budou naplánovány na 4 týdny po T0 (T1) a na 12 týdnů po T0 (T2). V T1 se zopakuje fyzikální a neurologické vyšetření a znovu se podají všechny klinické škály. V T2 budou všechna hodnocení provedená v T0 provedena znovu, včetně odběru krve.

V T0 a T2 se po noci nalačno mezi 8:00 a 10:00 provede odběr 40 ml žilní krve do zkumavek potažených kyselinou ethylendiamintetraoctovou (BD Vacutainer). Zkumavky budou kódovány a skladovány při pokojové teplotě až do zpracování, do 24 hodin. Kompletní krevní obraz s diferenciální analýzou bude proveden na samostatných krevních vzorcích.

Laboratorní metody

Měření cytokinů Možný vliv probiotické léčby na zánětlivý profil bude hodnocen měřením v T0 a T2 plazmatických hladin pro (např. Tumor Necrosis Factor (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ) a protizánětlivé cytokiny (Interleukin (IL)-10, IL-4). Alikvoty plazmy z každého vzorku budou odděleny a uloženy pro testy cytokinů. 2 ml čerstvé krve se odstřeďují při 1400 g po dobu 10 minut při teplotě místnosti a dva alikvoty plazmy po 350 ul se uloží do 1,5 ml lahviček pro testování hladin cytokinů.

Hodnocení imunitního fenotypu průtokovou cytometrií Za účelem prozkoumání možných změn imunitního fenotypu bude profil vrozené i adaptivní imunity prohlouben pomocí cytofluorimetrického hodnocení podle strategie popsané Kustrimovičem et al. v roce 2018 a s dalšími panely zaměřenými konkrétně na vrozenou imunitu. Budou hodnoceny následující buněčné podskupiny adaptivního imunitního systému: CD4+ a CD8+ T naivní/paměťové buňky, CD4+ T pomocné podskupiny a CD4+ regulační T buňky. Navíc pro vrozenou imunitu budou také hodnoceny monocyty a přirozené zabíječe (NK) buňky. Akvizice bude provedena na průtokovém cytometru Celesta pro třídění buněk BD Fluorescence-activated cell sorting (FACS) (Becton Dickinson Itálie, Milán, Itálie) se softwarem BD FACS Diva (verze 8.0.1.1) a data budou analyzována pomocí softwaru FlowJo (verze 10.7.1)

Hodnocení mRNA transkripčních faktorů Podle předchozích studií Kustrimovice a De Francesca bude také zkoumána schopnost probiotické léčby modifikovat hladiny mRNA hlavních transkripčních faktorů v CD4+ T lymfocytech. CD4+ pozitivní buňky budou získány pomocí PBMC, které budou izolovány z plné krve pomocí Ficoll-Paque Plus centrifugace v hustotním gradientu. Po resuspendování budou zbytkové kontaminující erytrocyty lyžovány přidáním 10 ml lyzačního pufru ((g/l) NH4CI 8,248, KHC03 1,0, EDTA 0,0368). Buňky budou dvakrát promyty v purifikovaném bovinním séru (PBS) přidáním 10 ml PBS, poté centrifugovány při 300 g po dobu 10 minut při teplotě místnosti a resuspendovány v 10 ml média Roswell Park Memorial Institute (RPMI)/10% fetální hovězí Sérum (FBS). Poté se provede ruční počítání buněk, aby se nastavilo množství separačních činidel CD4.

Typické přípravky PBMC budou obsahovat alespoň 80 % lymfocytů. CD4+ T buňky pak budou izolovány z PBMC pomocí Dynabeads CD4 Positive Isolation kit. Nejméně 50 000 separovaných CD4+ T buněk bude poté resuspendováno v PerfectPure RNA lyzačním pufru (5 Prime GmbH, Hamburg, Německo) a celková RNA bude extrahována pomocí PerfectPure RNA Cell Kit™.

Reverzní transkripce bude provedena na výsledné mRNA pomocí náhodného primeru a vysokokapacitní komplementární DNA (cDNA) kitu v reálném čase (RT).

RT-polymerázové řetězové reakce (PCR) budou provedeny s 1 μM cDNA. Amplifikace cDNA umožní analýzu hladin mRNA genů transkripčních faktorů TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 a NR4A2.

Složení a zdůvodnění léčby

Léčba:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Colony Forming Units (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Frukto-oligosacharidy FOS 2500 mg Maltodextrin.q.

Placebo:

Maltodextrin q.s.

Každá formulace probiotik obsahuje Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) a Bifidobacterium adolescentis (BA02). Frukto-oligosacharidy (FOS) se přidávají jako prebiotická složka a maltodextrin se používá jako plnidlo.

Výběr probiotik pro tuto studii je založen na solidních literárních údajích: zejména PBMC pacientů s PD léčených Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) vykazoval zvýšenou produkci protizánětlivého cytokinu IL-10. Uvedené ošetření také podpořilo obnovu integrity membrány v modelu buněk Cac02.

Všechna používaná probiotika jsou zahrnuta v „biologických látkách doporučených kvalifikovaným předpokladem bezpečnosti (QPS) záměrně přidávaným do potravin nebo krmiv, jak bylo oznámeno Evropskému úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) 12“.

Formulace placeba je složena výhradně z maltodextrinu.

Výpočet velikosti vzorku, analýza dat Návrh této studie je explorativní a stejně randomizovaný na léčbu probiotiky nebo placebem. Vzhledem k průzkumné povaze navrhované studie není striktně vyžadován formální výpočet velikosti vzorku. Velikost vzorku pro tuto studii tak vycházela především z předchozích výsledků z jiné studie in vitro, která přinesla statisticky významné výsledky u malé kohorty 40 pacientů s PD pro všechny testované probiotické kmeny, s globálním snížením produkce prozánětlivých cytokinů a zvýšením protizánětlivé cytokiny. V této studii bude očekávaný vzorek zdvojnásoben, přičemž bude odebráno celkem 80 vzorků v T0 i T2.

Data z předchozí studie in vitro byla použita k odhadu orientačních velikostí vzorků pro in vitro účinek všech testovaných probiotických kmenů a velikost vzorku 80 subjektů umožňuje určit většinu testovaných variací cytokinů s očekávanou silou větší než 80 %, nastavení práh statistické významnosti 0,05.

Statistická analýza shromážděných dat bude provedena po posouzení normality distribuce dat a za použití dvoustranného Studentova t testu nebo Mann-Whitneyho testu, jak je vhodné pro srovnání nezávislých proměnných. Korelace dat budou analyzovány pomocí Pearsonových nebo Spearmanových korelačních testů. ANOVA nebo Kruskal-Wallisovy testy se použijí pro srovnání mezi více než dvěma skupinami a párový t-test nebo Wilcoxonův test se znaménkem se použije při porovnávání párových skupin (např. výchozí hodnota versus konec léčby, léčba versus placebo). Prahové hodnoty pro statistickou významnost budou stanoveny podle specifických testovacích charakteristik.