Auswirkungen von Probiotika auf die periphere Immunität bei der Parkinson-Krankheit

Einleitung Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, von der jeweils bis zu 1-2 von 1000 Menschen betroffen sind. Die Prävalenz steigt mit zunehmendem Alter und wird bei Menschen über 65 auf 1 % geschätzt.

Es gibt keine verfügbare Behandlung, um den Ausbruch der Parkinson-Krankheit zu verhindern oder ihr Fortschreiten zu verzögern, und die Therapie konzentriert sich auf die Symptombehandlung. Die Verabreichung von Carbidopa/Levodopa ermöglicht die Kontrolle motorischer Symptome, verliert jedoch mit fortschreitender Krankheit an Wirksamkeit und steigende Tagesdosen führen zu häufigeren und schwerwiegenderen Nebenwirkungen.

Das histopathologische Kennzeichen der Parkinson-Krankheit ist der Verlust dopaminerger Neuronen und die Ansammlung von α-Synuclein (α-syn) in überlebenden Neuronen, die zugrunde liegende Pathophysiologie ist jedoch noch unklar. Es wurde vermutet, dass Entzündungsmechanismen eine herausragende Rolle bei der Krankheit spielen, wobei es zu einem Ungleichgewicht zwischen schädlichen und schützenden Immunfunktionen sowie zu Neurotoxizität durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) kommt.

Weitere Belege unterstreichen die Beteiligung der peripheren adaptiven Immunität an der Parkinson-Krankheit und berichten über ein Ungleichgewicht in T-Zell-Subpopulationen und in der Expression von Transkriptionsfaktoren in CD4+ T-Zellen bei Parkinson-Patienten.

Bei diesen Patienten können nichtmotorische Symptome dem Ausbruch einer klinisch etablierten Krankheit vorausgehen.

Die Ätiopathogenese der Parkinson-Krankheit ist noch unbekannt, aber die wegweisende Arbeit von Braak et al. vermuteten eine anfängliche Aggregation von α-syn im Darm mit anschließender Ausbreitung entlang des Vagusnervs zum Gehirn, um schließlich die Substantia nigra im Mittelhirn zu erreichen.

Interessanterweise verhinderte das Fehlen von Darmmikrobiota in einem α-syn-überexprimierenden Mausmodell der Parkinson-Krankheit sowohl die Mikroglia-Aktivierung als auch die motorische Beeinträchtigung, was auf eine grundlegende Rolle des Darms und der Mikrobiota bei der Pathogenese und Entwicklung der Parkinson-Krankheit hinweist.

In einer aktuellen Arbeit haben Magistrelli et al. bestätigte, dass Probiotika das periphere Immunsystem beeinflussen können. Insbesondere in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PMBCs) einer Kohorte von PD-Patienten konnten Probiotika die Produktion von Zytokinen in Richtung eines entzündungshemmenden Profils modulieren und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) reduzieren. Die klinischen Wirkungen von Probiotika wurden auch bei anderen pathologischen Erkrankungen untersucht. Tankou et al. verabreichte VSL#3 in einer Kohorte von 9 Multiple-Sklerose-Patienten, deren peripheres Immunsystem sich in Richtung eines entzündungshemmenden Profils verlagerte, mit umgekehrter Tendenz nach Absetzen von VSL#3. Diese Ergebnisse wurden von derselben Gruppe auch nach Verabreichung einer Mischung aus Probiotika (vier Lactobacillus-Stämme und drei Bifidobacterium-Stämme) bestätigt.

Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse konzipierten die Forscher eine randomisierte kontrollierte klinische Studie, deren Hauptziel darin besteht, zu testen, ob Probiotika das periphere Immunsystem in einer Kohorte von Parkinson-Patienten beeinflussen können. Ziel des Protokolls ist es, Veränderungen der Transkriptionsfaktoren, der Boten-Ribonukleinsäure (mRNA), der Lymphozyten-Subpopulationen (Th1, Th2, Th17 und Treg), der Zytokinspiegel und der ROS-Produktion hervorzuheben.

Methoden und Analysen Bei dieser explorativen Studie handelt es sich um eine randomisierte, placebokontrollierte Doppelblindstudie zur Bewertung der Wirksamkeit von Probiotika bei der Modulation des peripheren Immunsystems bei Parkinson-Patienten. Die Teilnehmer werden in zwei vergleichbare Gruppen randomisiert und drei Monate lang einmal täglich mit einer Mischung aus Probiotika oder einem passenden Placebo behandelt. Das Hauptziel dieser Studie besteht darin, die Auswirkungen von Probiotika auf das periphere Immunsystem zu überprüfen. Als explorative Ergebnisse werden motorische und nichtmotorische Symptome der Parkinson-Krankheit sowie die kognitive Funktion und Lebensqualität über den dreimonatigen Behandlungszeitraum anhand einer Auswahl klinischer Bewertungsskalen überwacht.

Teilnehmeridentifikation Die Probanden werden unter Patienten mit geplanten routinemäßigen Nachuntersuchungen an der Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara rekrutiert. Detaillierte Informationen zu Komorbiditäten, aktueller medizinischer Therapie und demografischen Daten dieser Probanden werden jederzeit verfügbar sein. Das Studiendesign wird kurz skizziert und die Patienten werden nach ihrem Interesse an einer Teilnahme gefragt. Willige Probanden nehmen an einem Screening-Besuch teil. Vor der Bestätigung der Berechtigung wird eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Prozessverfahren

Klinisch Während des Einschreibungsbesuchs wird durch eine medizinische und neurologische Untersuchung die Notwendigkeit sofortiger Änderungen in der medizinischen Therapie für jeden Teilnehmer beurteilt. Innerhalb von zwei Wochen wird jede Therapieänderung abgeschlossen sein und ein Basisbesuch wird geplant.

Während des Basisbesuchs (T0) werden körperliche und neurologische Untersuchungen wiederholt, um den Zustand des Probanden und das Fortbestehen der Einschlusskriterien zu bestätigen. Es wird eine Basisblutentnahme durchgeführt und alle klinischen Bewertungsskalen werden ausgefüllt, um die Basiswerte festzulegen. Jeder Teilnehmer wird nach Unterzeichnung einer entsprechenden Einverständniserklärung randomisiert und erhält eine Behandlungsbox, die Einzeldosisbeutel mit 2,7 g Pulver der zugewiesenen Formulierung enthält. Die Patienten werden angewiesen, die täglichen Dosen jeden Morgen vor dem Frühstück zu Hause einzunehmen und den Inhalt eines Beutels mit etwa 125 ml frischem Wasser oder einem anderen kalten, kohlensäurefreien Getränk zu vermischen. Die Teilnehmer werden angewiesen, unbenutzte oder leere Verpackungen zur Rücknahme und Compliance-Bewertung aufzubewahren.

Nachuntersuchungen werden 4 Wochen nach T0 (T1) und 12 Wochen nach T0 (T2) geplant. Bei T1 werden die körperliche und neurologische Untersuchung wiederholt und alle klinischen Skalen erneut verabreicht. Bei T2 werden alle bei T0 durchgeführten Untersuchungen erneut durchgeführt, einschließlich der Blutentnahme.

Bei T0 und T2 erfolgt die Entnahme von 40 ml venösem Blut nach einer Fastennacht zwischen 8:00 und 10:00 Uhr in mit Ethylendiamintetraessigsäure beschichteten Röhrchen (BD Vacutainer). Die Röhrchen werden kodiert und bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. An einzelnen Blutproben wird ein großes Blutbild mit Differentialanalyse durchgeführt.

Labormethoden

Zytokinmessung Der mögliche Einfluss einer probiotischen Behandlung auf das Entzündungsprofil wird durch Messung der Plasmaspiegel von Pro (z. B. Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ) und entzündungshemmende Zytokine (Interleukin (IL)-10, IL-4). Von jeder Probe werden Plasmaaliquots abgetrennt und für Zytokintests aufbewahrt. 2 ml frisches Blut werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1400 g zentrifugiert und zwei Plasma-Aliquots von jeweils 350 µL werden in 1,5-ml-Fläschchen gelagert, um die Zytokinspiegel zu bestimmen.

Durchflusszytometrische Bewertung des Immunphänotyps Um mögliche Veränderungen im Immunphänotyp zu untersuchen, wird das Profil sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunität mittels einer zytofluorimetrischen Bewertung gemäß der von Kustrimovic et al. beschriebenen Strategie vertieft. im Jahr 2018 und mit zusätzlichen Panels, die sich speziell der angeborenen Immunität widmen. Die folgenden Zelluntergruppen des adaptiven Immunsystems werden bewertet: CD4+- und CD8+-T-naive/Gedächtniszellen, CD4+-T-Helfer-Untergruppen und CD4+-regulatorische T-Zellen. Darüber hinaus werden im Hinblick auf die angeborene Immunität auch Monozyten und natürliche Killerzellen (NK) untersucht. Die Erfassung erfolgt auf einem Celesta-Durchflusszytometer mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) von BD (Becton Dickinson Italien, Mailand, Italien) mit der BD FACS Diva-Software (Version 8.0.1.1). und die Daten werden mit der FlowJo-Software (Version 10.7.1) analysiert.

Transkriptionsfaktoren-mRNA-Bewertung Nach früheren Studien von Kustrimovic und De Francesco wird auch die Fähigkeit einer probiotischen Behandlung untersucht, die mRNA-Spiegel der wichtigsten Transkriptionsfaktoren in CD4+-T-Lymphozyten zu verändern. CD4+-positive Zellen werden durch PBMC gewonnen, die mittels Ficoll-Paque Plus-Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut isoliert werden. Nach der Resuspension werden restliche kontaminierende Erythrozyten durch Zugabe von 10 ml Lysepuffer ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368) lysiert. Die Zellen werden zweimal in gereinigtem Rinderserum (PBS) durch Zugabe von 10 ml PBS gewaschen, dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 g zentrifugiert und in 10 ml Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI)/10 % fötales Rind resuspendiert Serum (FBS). Anschließend wird eine manuelle Zellzählung durchgeführt, um die Menge der CD4-Trennreagenzien festzulegen.

Typische PBMC-Präparate enthalten mindestens 80 % Lymphozyten. Anschließend werden CD4+-T-Zellen mithilfe des Dynabeads CD4 Positive Isolation Kit aus PBMC isoliert. Mindestens 50.000 abgetrennte CD4+ T-Zellen werden dann in PerfectPure RNA-Lysepuffer (5 Prime GmbH, Hamburg, Deutschland) resuspendiert und die Gesamt-RNA wird mit dem PerfectPure RNA Cell Kit™ extrahiert.

Die Reverse Transkription wird an der resultierenden mRNA unter Verwendung eines Zufallsprimers und eines Hochleistungs-Real-Time-Kits (RT) für komplementäre DNA (cDNA) durchgeführt.

RT-Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) werden mit 1 μM cDNA durchgeführt. Die Amplifikation der cDNA ermöglicht die Analyse der mRNA-Spiegel der Transkriptionsfaktor-Gene TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 und NR4A2.

Zusammensetzung und Begründung der Behandlung

Behandlung:

Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Koloniebildende Einheiten (KBE) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 KBE Bifidobacterium jugendlichis BA02 ≥ 1 x 10^9 KBE Fructo-Oligosaccharide FOS 2500 mg Maltodextrin q.s.

Placebo:

Maltodextrin q.s.

Jede Probiotikaformulierung enthält Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) und Bifidobacterium Adoleszenz (BA02). Fructo-Oligosaccharide (FOS) werden als präbiotische Komponente hinzugefügt und Maltodextrin wird als Füllstoff verwendet.

Die Wahl der Probiotika für diese Studie basiert auf soliden Literaturdaten: insbesondere PBMC von PD-Patienten, die mit Bifidobacterium animalis subsp. behandelt wurden. Lactis (BS01) zeigte eine erhöhte Produktion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10. Diese Behandlung unterstützte auch die Wiederherstellung der Membranintegrität in einem Modell von CacO2-Zellen.

Alle verwendeten Probiotika fallen unter die „Qualified Presumption of Safety (QPS) – empfohlene biologische Wirkstoffe, die Lebens- oder Futtermitteln absichtlich zugesetzt werden, wie der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) mitgeteilt 12“.

Die Placeboformulierung besteht ausschließlich aus Maltodextrin.

Berechnung der Stichprobengröße, Datenanalyse Das Design dieser Studie ist explorativ und gleichermaßen randomisiert auf die Behandlung mit Probiotika oder Placebo. Aufgrund des explorativen Charakters der vorgeschlagenen Studie ist eine formelle Berechnung der Stichprobengröße nicht unbedingt erforderlich. Die Stichprobengröße für diese Studie basierte daher hauptsächlich auf früheren Ergebnissen einer anderen In-vitro-Studie, die in einer kleinen Kohorte von 40 PD-Patienten für alle getesteten probiotischen Stämme statistisch signifikante Ergebnisse lieferte, mit einer globalen Verringerung der proinflammatorischen Zytokinproduktion und einem Anstieg von entzündungshemmende Zytokine. In der vorliegenden Studie wird die erwartete Probe verdoppelt, wobei insgesamt 80 Proben sowohl bei T0 als auch bei T2 gesammelt werden sollen.

Daten aus früheren In-vitro-Studien wurden verwendet, um Orientierungsprobengrößen für die In-vitro-Wirkung aller getesteten probiotischen Stämme zu schätzen, und eine Probengröße von 80 Probanden ermöglicht die Bestimmung der meisten getesteten Zytokinvariationen mit einer erwarteten Stärke von mehr als 80 % der Schwellenwert für die statistische Signifikanz liegt bei 0,05.

Die statistische Analyse der gesammelten Daten erfolgt nach der Beurteilung der Normalität der Datenverteilung und der Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests oder des Mann-Whitney-Tests, je nach Bedarf für Vergleiche unabhängiger Variablen. Datenkorrelationen werden durch Korrelationstests von Pearson oder Spearman analysiert. ANOVA- oder Kruskal-Wallis-Tests werden für Vergleiche zwischen mehr als zwei Gruppen verwendet, und der gepaarte t-Test oder Wilcoxon-Signed-Ranks-Test wird verwendet, wenn gepaarte Gruppen verglichen werden (z. B. Ausgangswert vs. Behandlungsende, Behandlung vs. Placebo). Schwellenwerte für die statistische Signifikanz werden entsprechend den spezifischen Testmerkmalen festgelegt.