Effekter av probiotika på perifer immunitet ved Parkinsons sykdom

Introduksjon Parkinsons sykdom (PD) er en vanlig nevrodegenerativ sykdom som rammer opptil 1-2 personer av 1000 til enhver tid. Prevalensen øker med alderen og anslås til 1 % hos personer over 65 år.

Det er ingen tilgjengelig behandling for å forhindre PD-utbrudd eller for å forsinke progresjonen, og terapi er fokusert på symptombehandling. Administrering av karbidopa/levodopa gir mulighet for kontroll av motoriske symptomer, men den blir mindre effektiv ettersom sykdommen utvikler seg og økende daglige doser gir hyppigere og alvorligere bivirkninger.

Det histopatologiske kjennetegnet ved PD er tap av dopaminerge nevroner og akkumulering av α-synuklein (α-syn) i overlevende nevroner, men den underliggende patofysiologien er fortsatt uklar. Inflammatoriske mekanismer har blitt foreslått å spille en fremtredende rolle i sykdommen, med en ubalanse mellom skadelige og beskyttende immunfunksjoner, samt nevrotoksisitet forårsaket av reaktive oksygenarter (ROS).

Ytterligere bevis fremhever involveringen av perifer adaptiv immunitet i PD, og ​​rapporterer en ubalanse i T-cellesubpopulasjoner og i uttrykket av transkripsjonelle faktorer i CD4+ T-celler hos PD-pasienter.

Hos disse pasientene kan ikke-motoriske symptomer gå før utbruddet av en klinisk etablert sykdom.

Etiopatogenesen av PD er fortsatt ukjent, men seminalt arbeid av Braak et al. antok en innledende aggregering av α-syn i tarmen med påfølgende forplantning langs vagusnerven til hjernen, og nådde til slutt substantia nigra i mesencephalon.

Interessant nok, i en α-syn-overuttrykkende murin modell av PD, forhindret fraværet av tarmmikrobiota både mikrogliaaktivering og motorisk svekkelse, og peker dermed på en grunnleggende rolle for tarmen og mikrobiotaen i patogenesen og utviklingen av PD.

I en fersk artikkel, Magistrelli et al. bekreftet at probiotika kan påvirke det perifere immunsystemet. Spesielt i perifere mononukleære blodceller (PMBC) fra en kohort av PD-pasienter, var probiotika i stand til å modulere produksjonen av cytokiner mot en anti-inflammatorisk profil og redusere produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS). De kliniske effektene av probiotika har også blitt utforsket ved andre patologiske tilstander. Tankou et al. administrert VSL#3 i en kohort på 9 multippel sklerosepasienter, hvis perifere immunsystem skiftet mot en antiinflammatorisk profil, med en omvendt tendens etter seponering av VSL#3. Disse resultatene ble også bekreftet av samme gruppe etter administrering av en blanding av probiotika (fire stammer av Lactobacillus og tre stammer av Bifidobacterium).

I lys av disse bevisene designet etterforskerne en randomisert kontrollert klinisk studie hvis primære mål er å teste om probiotika kan påvirke det perifere immunsystemet i en kohort av PD-pasienter. Målet med protokollen er å fremheve endringer i transkripsjonelle faktorer budbringer Ribonukleinsyre (mRNA) nivåer, lymfocytter subpopulasjoner (Th1, Th2, Th17 og Treg), cytokinnivåer og ROS produksjon.

Metoder og analyser Denne eksplorative studien er en randomisert placebokontrollert dobbeltblind studie for å evaluere effektiviteten av probiotika til å modulere det perifere immunsystemet hos personer med Parkinsons sykdom. Deltakerne vil bli randomisert i to sammenlignbare grupper og behandlet med en blanding av probiotika eller matchende placebo én gang daglig i tre måneder. Hovedmålet med denne studien er å verifisere effekten av probiotika på det perifere immunsystemet. Som utforskende utfall vil motoriske og ikke-motoriske symptomer på PD overvåkes, samt kognitiv funksjon og livskvalitet over den tre måneder lange behandlingsperioden via et utvalg av kliniske vurderingsskalaer.

Deltakeridentifikasjon Emner vil bli rekruttert blant pasienter med planlagte rutinemessige oppfølgingsbesøk ved Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Detaljert informasjon om komorbiditeter, gjeldende medisinsk terapi og demografiske data for disse individene vil være lett tilgjengelig. Prøvedesignet vil bli kort skissert og pasientene vil bli spurt om deres interesse for å delta. Villige forsøkspersoner vil delta på et screeningbesøk, skriftlig informert samtykke vil bli innhentet før kvalifisering bekreftes.

Prøveprosedyrer

Klinisk Under innmeldingsbesøk vil medisinsk og nevrologisk undersøkelse vurdere behovet for umiddelbare variasjoner i medisinsk terapi for hver deltaker. Innen to uker vil enhver terapimodifikasjon være fullført og baseline-besøk vil bli planlagt.

Under baseline-besøk (T0), vil fysiske og nevrologiske undersøkelser bli gjentatt for å bekrefte pasientens tilstand og vedholdende inklusjonskriterier, en baseline-blodavtaking vil bli utført og alle kliniske evalueringsskalaer vil bli fullført for å sette baseline-skårer. Hver deltaker, etter å ha tegnet et passende informert samtykke, vil bli randomisert og gitt en behandlingsboks som inneholder enkeltdoseposer med 2,7 g pulver av den tildelte formuleringen. Pasienter vil bli bedt om å ta daglige doser hjemme hver morgen før frokost, og blande innholdet i en pose i ca. 125 ml ferskvann eller annen kald, ikke-kullsyreholdig drikke. Deltakerne vil bli bedt om å oppbevare ubrukt eller tom emballasje for erindring og samsvarsevaluering.

Oppfølgingsbesøk vil bli planlagt 4 uker etter T0 (T1) og 12 uker etter T0 (T2). Ved T1 vil fysisk og nevrologisk undersøkelse gjentas og alle kliniske skalaer administreres på nytt. Ved T2 vil alle vurderinger utført ved T0 bli gjennomført på nytt, inkludert bloduttak.

Ved T0 og T2 vil uttak av 40 ml veneblod utføres etter en fastenatt, mellom kl. 8.00 og 10.00, i etylendiamintetraeddiksyrebelagte rør (BD Vacutainer). Rørene vil bli kodet og lagret ved romtemperatur frem til behandling, innen 24 timer. Fullstendig blodtelling med differensialanalyse vil bli utført på separate blodprøver.

Laboratoriemetoder

Cytokinmåling Den mulige påvirkningen av probiotisk behandling på inflammatorisk profil vil bli evaluert ved å måle plasmanivåene av pro (f.eks. Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-y) og antiinflammatoriske cytokiner (Interleukin (IL)-10, IL-4). Plasmaalikvoter fra hver prøve vil bli separert og lagret for cytokinanalyser. 2 mL friskt blod vil bli sentrifugert ved 1400 g i 10 minutter ved romtemperatur, og to plasmaalikvoter på 350 μL hver vil bli lagret i 1,5 mL hetteglass for å analysere cytokinnivåer.

Flowcytometrisk evaluering av immunfenotype For å undersøke mulige endringer i immunfenotype vil profilen av både medfødt og adaptiv immunitet bli utdypet ved hjelp av en cytofluorimetrisk evaluering i henhold til strategien beskrevet av Kustrimovic et al. i 2018 og med tilleggspaneler rettet spesielt mot medfødt immunitet. Følgende celleundergrupper av det adaptive immunsystemet vil bli vurdert: CD4+ og CD8+ T-naive/minneceller, CD4+ T-hjelperundersett og CD4+ regulatoriske T-celler. Dessuten, for medfødt immunitet, vil monocytter og Natural Killer (NK) celler også bli vurdert. Anskaffelsen vil bli utført på et BD fluorescensaktivert cellesortering (FACS) Celesta flowcytometer (Becton Dickinson Italia, Milano, Italia) med BD FACS Diva-programvare (versjon 8.0.1.1) og data vil bli analysert med FlowJo-programvare (versjon 10.7.1)

Transkripsjonsfaktorer mRNA-evaluering I følge tidligere studier av Kustrimovic og De Francesco, vil probiotisk behandlings evne til å modifisere mRNA-nivåer av de viktigste transkripsjonelle faktorene i CD4+ T-lymfocytter også bli undersøkt. CD4+ positive celler vil bli oppnådd av PBMC, som vil bli isolert fra fullblod ved hjelp av Ficoll-Paque Plus tetthetsgradient sentrifugering. Etter resuspensjon vil gjenværende kontaminerende erytrocytter lyseres ved tilsetning av 10 ml lyseringsbuffer ((g/l) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Celler vil bli vasket to ganger i Purified Bovine Serum (PBS) ved tilsetning av 10 ml PBS, deretter sentrifugert ved 300 g i 10 minutter ved romtemperatur og resuspendert i 10 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/10 % Fetal Bovine Serum (FBS). Manuell celleteller vil deretter bli utført for å stille inn CD4-separasjonsreagensmengder.

Typiske PBMC-preparater vil inneholde minst 80 % lymfocytter. CD4+ T-celler vil deretter bli isolert fra PBMC ved hjelp av Dynabeads CD4 Positive Isolation kit. Minst 50 000 separerte CD4+ T-celler vil deretter bli resuspendert i PerfectPure RNA-lysebuffer (5 Prime GmbH, Hamburg, Tyskland), og totalt RNA vil bli ekstrahert av PerfectPure RNA Cell Kit™.

Omvendt transkripsjon vil bli utført på resulterende mRNA ved bruk av en tilfeldig primer og et høykapasitets komplementært DNA (cDNA) sanntid (RT) kit.

RT-Polymerase Chain Reactions (PCR) vil bli utført med 1 μM cDNA. Amplifisering av cDNA vil tillate analyse av mRNA-nivåer av transkripsjonsfaktorgenene TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 og NR4A2.

Behandlingens sammensetning og begrunnelse

Behandling:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Colony Forming Units (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fructo-oligosaccharides mg Mal.todex.500 FOS.

Placebo:

Maltodekstrin q.s.

Hver probiotikaformulering inneholder Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) og Bifidobacterium adolescentis (BA02). Frukto-oligosakkarider (FOS) tilsettes som en prebiotisk komponent og maltodekstrin brukes som bulkmiddel.

Valget av probiotika for denne studien er basert på solide litteraturdata: spesielt PBMC fra PD-pasienter behandlet med Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) viste en økt produksjon av antiinflammatorisk cytokin IL-10. Nevnte behandling støttet også gjenoppretting av membranintegritet i en modell av CacO2-celler.

Alle probiotika som brukes er inkludert i "Qualified Presumption of Safety (QPS)-anbefalte biologiske midler som med vilje er tilsatt til mat eller fôr som varslet til European Food Safety Authority (EFSA) 12".

Placeboformuleringen består utelukkende av maltodekstrin.

Prøvestørrelsesberegning, dataanalyse Designet av denne studien er utforskende og like randomisert til behandling med probiotika eller placebo. På grunn av den utforskende karakteren til den foreslåtte studien, er en formell prøvestørrelsesberegning strengt tatt ikke nødvendig. Prøvestørrelse for denne studien har således hovedsakelig vært basert på tidligere resultater fra en annen in vitro-studie, som ga statistisk signifikante resultater i en liten kohort på 40 PD-pasienter for alle testede probiotiske stammer, med en global reduksjon i proinflammatorisk cytokinproduksjon og en økning i anti-inflammatoriske cytokiner. I denne studien vil den forventede prøven bli doblet, med totalt 80 prøver som skal tas både ved T0 og T2.

Data fra tidligere in vitro-studier har blitt brukt til å estimere orienterende prøvestørrelser for in vitro-effekten av alle testede probiotiske stammer, og en prøvestørrelse på 80 forsøkspersoner gjør det mulig å bestemme de fleste testede cytokinvariasjoner med en forventet effekt større enn 80 %, innstilling terskelen for statistisk signifikans ved 0,05.

Statistisk analyse av innsamlede data vil bli utført etter å ha vurdert normaliteten til datadistribusjonen og ved å bruke to-halet Student's t-test eller Mann-Whitney-test etter behov for uavhengige variable sammenligninger. Datakorrelasjoner vil bli analysert gjennom Pearsons eller Spearmans korrelasjonstester. ANOVA eller Kruskal-Wallis-testene vil bli brukt for sammenligninger mellom mer enn to grupper, og paret t-test eller Wilcoxon signed ranks test vil bli brukt når man sammenligner sammenkoblede grupper (f.eks. grunnlinje vs behandlingsslutt, behandling vs placebo). Terskler for statistisk signifikans vil bli satt i henhold til de spesifikke testkarakteristikkene.