Wpływ probiotyków na odporność obwodową w chorobie Parkinsona

Wprowadzenie Choroba Parkinsona (PD) jest częstą chorobą neurodegeneracyjną, dotykającą w dowolnym momencie do 1-2 osób na 1000. Częstość występowania wzrasta wraz z wiekiem i szacuje się ją na 1% u osób powyżej 65 roku życia.

Nie ma dostępnego leczenia, które zapobiegałoby wystąpieniu PD lub opóźniało jej postęp, a terapia koncentruje się na leczeniu objawów. Podawanie karbidopy/lewodopy pozwala na kontrolę objawów ruchowych, jednak wraz z postępem choroby staje się mniej skuteczne, a zwiększanie dziennych dawek powoduje częstsze i cięższe działania niepożądane.

Histopatologiczną cechą charakterystyczną PD jest utrata neuronów dopaminergicznych i nagromadzenie α-synukleiny (α-syn) w neuronach, które przeżyły, ale podstawowa patofizjologia jest nadal niejasna. Sugeruje się, że mechanizmy zapalne odgrywają znaczącą rolę w chorobie, z brakiem równowagi między szkodliwymi i ochronnymi funkcjami odpornościowymi, a także neurotoksycznością powodowaną przez reaktywne formy tlenu (ROS).

Dalsze dowody podkreślają udział obwodowej odporności adaptacyjnej w PD, zgłaszając brak równowagi w subpopulacjach limfocytów T oraz w ekspresji czynników transkrypcyjnych w limfocytach T CD4+ u pacjentów z PD.

U tych pacjentów objawy niemotoryczne mogą poprzedzać wystąpienie klinicznie potwierdzonej choroby.

Etiopatogeneza PD jest nadal nieznana, ale przełomowa praca Braaka i wsp. wysunęli hipotezę o początkowej agregacji α-syn w jelicie z późniejszą propagacją wzdłuż nerwu błędnego do mózgu, ostatecznie docierając do istoty czarnej w śródmózgowiu.

Co ciekawe, w mysim modelu PD z nadekspresją α-syn brak mikroflory jelitowej zapobiegał zarówno aktywacji mikrogleju, jak i upośledzeniu ruchowemu, wskazując w ten sposób na fundamentalną rolę jelit i mikroflory w patogenezie i rozwoju PD.

W niedawnym artykule Magistrelli i in. potwierdziły, że probiotyki mogą wpływać na obwodowy układ odpornościowy. W szczególności w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PMBC) kohorty pacjentów z PD probiotyki były w stanie modulować produkcję cytokin w kierunku profilu przeciwzapalnego i zmniejszać wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS). Kliniczne działanie probiotyków badano również w innych stanach patologicznych. Tankou i in. podali VSL#3 kohorcie 9 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, których obwodowy układ odpornościowy przesunął się w kierunku profilu przeciwzapalnego, z odwrotną tendencją po odstawieniu VSL#3. Wyniki te zostały również potwierdzone przez tę samą grupę po podaniu mieszanki probiotyków (cztery szczepy Lactobacillus i trzy szczepy Bifidobacterium).

W świetle tych dowodów badacze zaprojektowali randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, którego głównym celem jest sprawdzenie, czy probiotyki mogą wpływać na obwodowy układ odpornościowy w kohorcie pacjentów z PD. Celem protokołu jest zwrócenie uwagi na zmiany w poziomach kwasu rybonukleinowego (mRNA) przekaźników czynników transkrypcyjnych, subpopulacjach limfocytów (Th1, Th2, Th17 i Treg), poziomach cytokin i wytwarzaniu ROS.

Metody i analizy To badanie eksploracyjne jest randomizowanym, kontrolowanym placebo badaniem z podwójnie ślepą próbą, mającym na celu ocenę skuteczności probiotyków w modulowaniu obwodowego układu odpornościowego u pacjentów z chorobą Parkinsona. Uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do dwóch porównywalnych grup i leczeni mieszaniną probiotyków lub pasującym placebo raz dziennie przez trzy miesiące. Głównym celem pracy jest weryfikacja wpływu probiotyków na obwodowy układ odpornościowy. Jako wyniki eksploracyjne monitorowane będą motoryczne i niemotoryczne objawy PD, a także funkcje poznawcze i jakość życia w ciągu trzymiesięcznego okresu leczenia za pomocą wybranych skal oceny klinicznej.

Identyfikacja uczestników Pacjenci będą rekrutowani spośród pacjentów z zaplanowanymi rutynowymi wizytami kontrolnymi w Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Szczegółowe informacje na temat chorób współistniejących, aktualnej terapii medycznej oraz danych demograficznych tych osób będą łatwo dostępne. Projekt badania zostanie pokrótce przedstawiony, a pacjenci zostaną zapytani o zainteresowanie udziałem. Chętni uczestnicy wezmą udział w wizycie przesiewowej, pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana przed potwierdzeniem kwalifikowalności.

Procedury próbne

Kliniczny Podczas wizyty rejestracyjnej badanie lekarskie i neurologiczne oceni potrzebę natychmiastowych zmian w terapii medycznej dla każdego uczestnika. W ciągu dwóch tygodni wszelkie modyfikacje terapii zostaną zakończone i wyznaczona zostanie wizyta wyjściowa.

Podczas wizyty wyjściowej (T0) zostaną powtórzone badania fizykalne i neurologiczne w celu potwierdzenia stanu pacjenta i utrzymywania się kryteriów włączenia, zostanie przeprowadzone podstawowe pobranie krwi i wszystkie skale oceny klinicznej zostaną zakończone w celu ustalenia wyników wyjściowych. Każdy uczestnik, po podpisaniu stosownej świadomej zgody, zostanie losowo przydzielony i otrzyma pudełko zabiegowe zawierające jednodawkowe saszetki z 2,7 g proszku o przydzielonym składzie. Pacjenci zostaną poinstruowani, aby codziennie rano przed śniadaniem przyjmować dawki w domu, mieszając zawartość jednej saszetki z około 125 ml świeżej wody lub innego zimnego, niegazowanego napoju. Uczestnicy zostaną poinstruowani, aby zachować nieużywane lub puste opakowania do ponownego wykorzystania i oceny zgodności.

Wizyty kontrolne zaplanowano na 4 tygodnie po T0 (T1) i 12 tygodni po T0 (T2). W T1 powtórzy się badanie fizykalne i neurologiczne i ponownie zastosuje wszystkie skale kliniczne. W T2 wszystkie oceny wykonane w T0 zostaną przeprowadzone ponownie, w tym pobranie krwi.

W T0 i T2 pobranie 40 ml krwi żylnej nastąpi po nocy na czczo, między godziną 8:00 a 10:00, do probówek pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (BD Vacutainer). Probówki będą kodowane i przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu przetworzenia, w ciągu 24 godzin. Pełna morfologia krwi z analizą różnicową zostanie przeprowadzona na oddzielnych próbkach krwi.

Metody laboratoryjne

Pomiar cytokin Możliwy wpływ leczenia probiotykami na profil stanu zapalnego zostanie oceniony poprzez pomiar w T0 i T2 stężeń pro w osoczu (np. czynnik martwicy nowotworów (TNF)-α, interferon (IFN)-γ) oraz cytokiny przeciwzapalne (interleukina (IL)-10, IL-4). Porcje osocza z każdej próbki będą rozdzielone i przechowywane do testów cytokin. 2 ml świeżej krwi będzie odwirowywane przy 1400 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a dwie porcje osocza po 350 µl każda będą przechowywane w 1,5 ml fiolkach w celu oznaczenia poziomów cytokin.

Ocena fenotypu immunologicznego za pomocą cytometrii przepływowej W celu zbadania możliwych zmian w fenotypie immunologicznym profil odporności wrodzonej i nabytej zostanie pogłębiony za pomocą oceny cytofluorymetrycznej zgodnie ze strategią opisaną przez Kustrimovic et al. w 2018 r. oraz z dodatkowymi panelami ukierunkowanymi specjalnie na odporność wrodzoną. Ocenione zostaną następujące podzbiory komórek adaptacyjnego układu odpornościowego: komórki T naiwne/pamięci CD4+ i CD8+, podzbiory komórek pomocniczych T CD4+ i regulatorowe limfocyty T CD4+. Ponadto pod kątem odporności wrodzonej oceniane będą również monocyty i komórki NK. Akwizycja zostanie przeprowadzona przy użyciu cytometru przepływowego BD Celesta do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (Becton Dickinson, Włochy, Mediolan, Włochy) z oprogramowaniem BD FACS Diva (wersja 8.0.1.1) a dane będą analizowane za pomocą oprogramowania FlowJo (wersja 10.7.1)

Ocena mRNA czynników transkrypcyjnych Zgodnie z wcześniejszymi badaniami Kustrimovic i De Francesco, badana będzie również zdolność leczenia probiotykami do modyfikowania poziomu mRNA głównych czynników transkrypcyjnych w limfocytach T CD4+. Komórki CD4+ dodatnie zostaną uzyskane przez PBMC, które zostaną wyizolowane z pełnej krwi przy użyciu wirowania w gradiencie gęstości Ficoll-Paque Plus. Po ponownym zawieszeniu, pozostałe zanieczyszczające erytrocyty zostaną poddane lizie przez dodanie 10 ml buforu do lizy ((g/l) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Komórki przemywa się dwukrotnie oczyszczoną surowicą bydlęcą (PBS) przez dodanie 10 ml PBS, a następnie odwirowuje przy 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesza w 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI)/10% płodu bydlęcego Surowica (FBS). Następnie zostanie wykonane ręczne zliczanie komórek w celu ustawienia ilości odczynników rozdzielających CD4.

Typowe preparaty PBMC będą zawierać co najmniej 80% limfocytów. Limfocyty T CD4+ zostaną następnie wyizolowane z PBMC za pomocą zestawu Dynabeads CD4 Positive Isolation. Co najmniej 50 000 oddzielonych limfocytów T CD4+ zostanie następnie ponownie zawieszonych w buforze do lizy PerfectPure RNA (5 Prime GmbH, Hamburg, Niemcy), a całkowity RNA zostanie wyekstrahowany za pomocą zestawu PerfectPure RNA Cell Kit™.

Odwrotna transkrypcja zostanie przeprowadzona na otrzymanym mRNA przy użyciu losowego startera i zestawu komplementarnego DNA (cDNA) o dużej pojemności w czasie rzeczywistym (RT).

Reakcje łańcuchowe polimerazy RT (PCR) zostaną przeprowadzone z użyciem 1 μM cDNA. Amplifikacja cDNA pozwoli na analizę poziomów mRNA genów czynników transkrypcyjnych TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 i NR4A2.

Skład i uzasadnienie leczenia

Leczenie:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 jednostek tworzących kolonie (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fruktooligosacharydy FOS 2500 mg Maltodekstryna q.s.

Placebo:

maltodekstryna qs

Każdy preparat probiotyczny zawiera Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) i Bifidobacterium adolescentis (BA02). Fruktooligosacharydy (FOS) są dodawane jako składnik prebiotyczny, a maltodekstryna jest stosowana jako substancja wypełniająca.

Wybór probiotyków do tego badania opiera się na solidnych danych literaturowych: w szczególności PBMC pacjentów z PD leczonych Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) wykazał zwiększoną produkcję przeciwzapalnej cytokiny IL-10. Wspomniane traktowanie wspierało również przywrócenie integralności błony w modelu komórek CacO2.

Wszystkie stosowane probiotyki należą do „Zalecanych przez kwalifikowane domniemanie bezpieczeństwa (QPS) czynników biologicznych celowo dodawanych do żywności lub paszy zgodnie z powiadomieniem Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) 12”.

Preparat placebo składa się wyłącznie z maltodekstryny.

Obliczenie wielkości próby, analiza danych Projekt tego badania ma charakter eksploracyjny i jest równie randomizowany do leczenia probiotykami lub placebo. Ze względu na eksploracyjny charakter proponowanego badania formalne obliczenie liczebności próby nie jest bezwzględnie wymagane. Wielkość próby do tego badania została zatem oparta głównie na wcześniejszych wynikach innego badania in vitro, które dało statystycznie istotne wyniki w małej kohorcie 40 pacjentów z PD dla wszystkich testowanych szczepów probiotycznych, z globalnym zmniejszeniem produkcji cytokin prozapalnych i wzrostem cytokiny przeciwzapalne. W niniejszym badaniu oczekiwana próba zostanie podwojona, w sumie 80 próbek zostanie pobranych zarówno w T0, jak i T2.

Dane z poprzednich badań in vitro zostały wykorzystane do oszacowania orientacyjnych rozmiarów próbek dla efektu in vitro wszystkich testowanych szczepów probiotycznych, a wielkość próby 80 osobników pozwala na określenie większości testowanych zmian cytokin z oczekiwaną mocą większą niż 80%, ustalając próg istotności statystycznej na poziomie 0,05.

Analiza statystyczna zebranych danych zostanie przeprowadzona po ocenie normalności rozkładu danych i zastosowaniu dwustronnego testu t Studenta lub odpowiednio testu Manna-Whitneya do porównań zmiennych niezależnych. Korelacje danych będą analizowane za pomocą testów korelacji Pearsona lub Spearmana. ANOVA lub testy Kruskala-Wallisa zostaną użyte do porównań między więcej niż dwiema grupami, a sparowany test t lub test rang ze znakami Wilcoxona zostaną użyte do porównania sparowanych grup (np. punkt początkowy vs koniec leczenia, leczenie vs placebo). Progi istotności statystycznej zostaną ustalone zgodnie ze specyficzną charakterystyką testu.