Efeitos dos probióticos na imunidade periférica na doença de Parkinson

Introdução A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa comum, afetando até 1-2 pessoas em 1.000 a qualquer momento. A prevalência aumenta com a idade e é estimada em 1% em pessoas com mais de 65 anos.

Não há tratamento disponível para prevenir o aparecimento da DP ou retardar sua progressão e a terapia é focada no controle dos sintomas. A administração de carbidopa/levodopa permite o controle dos sintomas motores, mas torna-se menos eficaz à medida que a doença progride e o aumento das doses diárias causa efeitos colaterais mais frequentes e graves.

A marca histopatológica da DP é a perda de neurônios dopaminérgicos e o acúmulo de α-sinucleína (α-syn) nos neurônios sobreviventes, mas a fisiopatologia subjacente ainda não está clara. Mecanismos inflamatórios têm sido sugeridos para desempenhar um papel proeminente na doença, com um desequilíbrio entre funções imunológicas prejudiciais e protetoras, bem como neurotoxicidade causada por espécies reativas de oxigênio (ROS).

Outras evidências destacam o envolvimento da imunidade adaptativa periférica na DP, relatando um desequilíbrio nas subpopulações de células T e na expressão de fatores de transcrição em células T CD4+ em pacientes com DP.

Nesses pacientes, os sintomas não motores podem preceder o início de uma doença clinicamente estabelecida.

A etiopatogenia da DP ainda é desconhecida, mas o trabalho seminal de Braak et al. hipotetizou uma agregação inicial de α-syn no intestino com subsequente propagação ao longo do nervo vago até o cérebro, finalmente alcançando a substância negra no mesencéfalo.

Curiosamente, em um modelo murino de DP com superexpressão de α-syn, a ausência de microbiota intestinal impediu tanto a ativação da micróglia quanto o comprometimento motor, apontando assim para um papel fundamental do intestino e da microbiota na patogênese e desenvolvimento da DP.

Em um artigo recente, Magistrelli et al. confirmaram que os probióticos podem influenciar o sistema imunológico periférico. Particularmente, nas células mononucleares do sangue periférico (PMBCs) de uma coorte de pacientes com DP, os probióticos foram capazes de modular a produção de citocinas para um perfil anti-inflamatório e reduzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Os efeitos clínicos dos probióticos também foram explorados em outras condições patológicas. Tankou et ai. administrou VSL#3 em uma coorte de 9 pacientes com esclerose múltipla, cujo sistema imunológico periférico mudou para um perfil anti-inflamatório, com tendência inversa após a descontinuação do VSL#3. Esses resultados também foram confirmados pelo mesmo grupo após a administração de uma mistura de probióticos (quatro cepas de Lactobacillus e três cepas de Bifidobacterium).

À luz dessas evidências, os pesquisadores desenharam um ensaio clínico controlado randomizado cujo objetivo principal é testar se os probióticos podem influenciar o sistema imunológico periférico em uma coorte de pacientes com DP. O objetivo do protocolo é destacar mudanças nos níveis de ácidos ribonucleicos (mRNA) mensageiros dos fatores de transcrição, subpopulações de linfócitos (Th1, Th2, Th17 e Treg), níveis de citocinas e produção de ROS.

Métodos e análises Este estudo exploratório é um estudo randomizado, controlado por placebo, duplo-cego para avaliar a eficácia dos probióticos na modulação do sistema imunológico periférico em indivíduos com doença de Parkinson. Os participantes serão randomizados em dois grupos comparáveis ​​e tratados com uma mistura de probióticos ou placebo uma vez ao dia durante três meses. O objetivo primário deste estudo é verificar os efeitos dos probióticos no sistema imunológico periférico. Como resultados exploratórios, os sintomas motores e não motores da DP serão monitorados, bem como a função cognitiva e a qualidade de vida durante o período de tratamento de três meses por meio de uma seleção de escalas de classificação clínica.

Identificação do participante Os participantes serão recrutados entre pacientes com consultas de acompanhamento de rotina agendadas na Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Informações detalhadas sobre comorbidades, terapia médica atual e dados demográficos desses indivíduos estarão prontamente disponíveis. O desenho do estudo será brevemente descrito e os pacientes serão questionados sobre seu interesse em participar. Indivíduos dispostos participarão de uma visita de triagem, consentimento informado por escrito será obtido antes de confirmar a elegibilidade.

Procedimentos de julgamento

Clínica Durante a visita de inscrição, o exame médico e neurológico avaliará a necessidade de variações imediatas na terapia médica para cada participante. Dentro de duas semanas, qualquer modificação da terapia será concluída e a visita inicial será agendada.

Durante a visita inicial (T0), os exames físicos e neurológicos serão repetidos para confirmar as condições do sujeito e a persistência dos critérios de inclusão, uma coleta de sangue inicial será realizada e todas as escalas de avaliação clínica serão preenchidas para definir os escores iniciais. Cada participante, após a assinatura de um consentimento informado apropriado, será randomizado e receberá uma caixa de tratamento, contendo sachês de dose única com 2,7g de pó da formulação alocada. Os pacientes serão instruídos a tomar doses diárias em casa todas as manhãs antes do café da manhã, misturando o conteúdo de um sachê em cerca de 125 ml de água fresca ou outra bebida fria e não carbonatada. Os participantes serão instruídos a manter as embalagens vazias ou não utilizadas para coleta e avaliação de conformidade.

As visitas de acompanhamento serão agendadas 4 semanas após T0 (T1) e 12 semanas após T0 (T2). Em T1, o exame físico e neurológico será repetido e todas as escalas clínicas serão aplicadas novamente. Em T2, todas as avaliações realizadas em T0 serão refeitas, inclusive a coleta de sangue.

Em T0 e T2, será realizada a retirada de 40 ml de sangue venoso após jejum noturno, entre 8h e 10h, em tubos revestidos com ácido etilenodiaminotetracético (BD Vacutainer). Os tubos serão codificados e armazenados em temperatura ambiente até o processamento, em até 24 horas. O hemograma completo com análise diferencial será realizado em amostras de sangue separadas.

Métodos laboratoriais

Medição de citocinas A possível influência do tratamento com probióticos no perfil inflamatório será avaliada medindo em T0 e T2 os níveis plasmáticos de pro (por exemplo, Fator de Necrose Tumoral (TNF)-α, Interferon (IFN)-γ) e citocinas antiinflamatórias (Interleucina (IL)-10, IL-4). Alíquotas de plasma de cada amostra serão separadas e armazenadas para ensaios de citocinas. 2 mL de sangue fresco serão centrifugados a 1400g por 10 minutos em temperatura ambiente e duas alíquotas de plasma de 350 µL cada serão armazenadas em frascos de 1,5mL para dosagem dos níveis de citocinas.

Avaliação do fenótipo imunológico por citometria de fluxo Para investigar possíveis alterações no fenótipo imunológico, o perfil da imunidade inata e adaptativa será aprofundado por meio de uma avaliação citofluorimétrica de acordo com a estratégia descrita por Kustrimovic et al. em 2018 e com painéis adicionais voltados especificamente para a imunidade inata. Serão avaliados os seguintes subconjuntos de células do sistema imune adaptativo: células T virgens/de memória CD4+ e CD8+, subconjuntos T auxiliares CD4+ e células T reguladoras CD4+. Além disso, para imunidade inata, monócitos e células Natural Killer (NK) também serão avaliados. A aquisição será realizada em um citômetro de fluxo BD Fluorescence-activated cell sorting (FACS) Celesta (Becton Dickinson Itália, Milão, Itália) com o software BD FACS Diva (versão 8.0.1.1) e os dados serão analisados ​​com o software FlowJo (versão 10.7.1)

Avaliação de mRNA de fatores de transcrição De acordo com estudos anteriores de Kustrimovic e De Francesco, também será investigada a capacidade do tratamento com probióticos em modificar os níveis de mRNA dos principais fatores de transcrição em linfócitos T CD4+. Células CD4+ positivas serão obtidas por PBMC, que serão isoladas do sangue total por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus. Após a ressuspensão, os eritrócitos contaminantes residuais serão lisados ​​pela adição de 10 mL de tampão de lise ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). As células serão lavadas duas vezes em Soro Bovino Purificado (PBS) pela adição de 10 mL de PBS, depois centrifugadas a 300 g por 10 min em temperatura ambiente e ressuspensas em 10 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)/10% Fetal Bovine Soro (FBS). A contagem manual de células será realizada para definir as quantidades de reagentes de separação de CD4.

As preparações típicas de PBMC conterão pelo menos 80% de linfócitos. As células T CD4+ serão então isoladas das PBMC por meio do kit Dynabeads CD4 Positive Isolation. Pelo menos 50.000 células T CD4+ separadas serão ressuspensas em tampão de lise de RNA PerfectPure (5 Prime GmbH, Hamburgo, Alemanha) e o RNA total será extraído pelo PerfectPure RNA Cell Kit™.

A transcrição reversa será realizada no mRNA resultante usando um primer aleatório e um kit de DNA complementar de alta capacidade (cDNA) em tempo real (RT).

RT-Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) será realizada com 1 μM de cDNA. A amplificação do cDNA permitirá a análise dos níveis de mRNA dos genes do fator de transcrição TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 e NR4A2.

Composição e justificativa do tratamento

Tratamento:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Unidades Formadoras de Colônias (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescenteis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fruto-oligossacarídeos FOS 2500 mg Maltodextrina q.s.

Placebo:

Maltodextrina q.s.

Cada formulação probiótica contém Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) e Bifidobacterium adolescenteis (BA02). Fruto-oligossacarídeos (FOS) são adicionados como um componente prebiótico e a maltodextrina é usada como agente de volume.

A escolha de probióticos para este estudo é baseada em dados sólidos da literatura: em particular PBMC de pacientes com DP tratados com Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) apresentou aumento da produção da citocina anti-inflamatória IL-10. O referido tratamento também apoiou a restauração da integridade da membrana em um modelo de células CacO2.

Todos os probióticos usados ​​estão incluídos nos "agentes biológicos recomendados por presunção qualificada de segurança (QPS) adicionados intencionalmente a alimentos ou rações, conforme notificado à Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA) 12".

A formulação placebo é composta exclusivamente por maltodextrina.

Cálculo do tamanho da amostra, análise dos dados O desenho deste estudo é exploratório e igualmente randomizado para tratamento com probióticos ou placebo. Devido à natureza exploratória do estudo proposto, um cálculo formal do tamanho da amostra não é estritamente necessário. O tamanho da amostra para este estudo foi baseado principalmente em resultados anteriores de outro estudo in vitro, que produziu resultados estatisticamente significativos em uma pequena coorte de 40 pacientes com DP para todas as cepas probióticas testadas, com uma redução global na produção de citocinas pró-inflamatórias e um aumento na citocinas anti-inflamatórias. No presente estudo, a amostra esperada será duplicada, com um total de 80 espécimes a serem coletados tanto em T0 quanto em T2.

Os dados do estudo in vitro anterior foram usados ​​para estimar tamanhos de amostra de orientação para o efeito in vitro de todas as cepas probióticas testadas e um tamanho de amostra de 80 indivíduos permite a determinação da maioria das variações de citocinas testadas com um poder esperado superior a 80%, configurando o limite para significância estatística em 0,05.

A análise estatística dos dados coletados será realizada após avaliação da normalidade da distribuição dos dados e uso do teste t de Student bicaudal ou teste de Mann-Whitney, conforme apropriado para comparações de variáveis ​​independentes. As correlações dos dados serão analisadas através dos testes de correlação de Pearson ou Spearman. ANOVA ou os testes de Kruskal-Wallis serão usados ​​para comparações entre mais de dois grupos e o teste t pareado ou o teste de classificação sinalizada de Wilcoxon serão usados ​​ao comparar grupos pareados (por exemplo, linha de base vs fim do tratamento, tratamento vs placebo). Os limites para significância estatística serão definidos de acordo com as características específicas do teste.