Влияние пробиотиков на периферический иммунитет при болезни Паркинсона

Введение Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, поражающим до 1-2 человек из 1000 в любой момент времени. Распространенность увеличивается с возрастом и оценивается в 1% у людей старше 65 лет.

Не существует доступного лечения, чтобы предотвратить начало БП или отсрочить его прогрессирование, и терапия сосредоточена на управлении симптомами. Применение карбидопы/леводопы позволяет контролировать двигательные симптомы, но по мере прогрессирования заболевания эффективность снижается, а увеличение суточной дозы вызывает более частые и тяжелые побочные эффекты.

Гистопатологическим признаком БП является потеря дофаминергических нейронов и накопление α-синуклеина (α-син) в выживших нейронах, но основная патофизиология до сих пор неясна. Было высказано предположение, что воспалительные механизмы играют заметную роль в заболевании с дисбалансом между вредными и защитными иммунными функциями, а также с нейротоксичностью, вызванной активными формами кислорода (АФК).

Дополнительные данные подчеркивают участие периферического адаптивного иммунитета в БП, сообщая о дисбалансе субпопуляций Т-клеток и экспрессии факторов транскрипции в CD4+ Т-клетках у пациентов с БП.

У этих больных немоторные симптомы могут предшествовать началу клинически установленного заболевания.

Этиопатогенез БП до сих пор неизвестен, но основополагающая работа Braak et al. предположили начальную агрегацию α-син в кишечнике с последующим распространением по блуждающему нерву в головной мозг, достигая, наконец, черной субстанции в среднем мозге.

Интересно, что в мышиной модели БП со сверхэкспрессией α-син отсутствие микробиоты кишечника предотвращало как активацию микроглии, так и двигательные нарушения, что указывает на фундаментальную роль кишечника и микробиоты в патогенезе и развитии БП.

В недавней статье Magistrelli et al. подтвердили, что пробиотики могут влиять на периферическую иммунную систему. В частности, в мононуклеарных клетках периферической крови (PMBC) когорты пациентов с БП пробиотики были способны модулировать выработку цитокинов в сторону противовоспалительного профиля и снижать выработку активных форм кислорода (АФК). Клинические эффекты пробиотиков также изучались при других патологических состояниях. Танкоу и др. вводили VSL#3 группе из 9 пациентов с рассеянным склерозом, чья периферическая иммунная система сместилась в сторону противовоспалительного профиля с обратной тенденцией после прекращения VSL#3. Эти результаты были также подтверждены той же группой после введения смеси пробиотиков (четыре штамма Lactobacillus и три штамма Bifidobacterium).

В свете этих данных исследователи разработали рандомизированное контролируемое клиническое исследование, основной целью которого является проверка того, могут ли пробиотики влиять на периферическую иммунную систему у когорты пациентов с БП. Целью протокола является выделение изменений в уровнях рибонуклеиновой кислоты (мРНК) мессенджера факторов транскрипции, субпопуляциях лимфоцитов (Th1, Th2, Th17 и Treg), уровнях цитокинов и продукции АФК.

Методы и анализ Это предварительное исследование представляет собой рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое исследование для оценки эффективности пробиотиков в модулировании периферической иммунной системы у субъектов с болезнью Паркинсона. Участники будут рандомизированы в две сопоставимые группы и будут получать смесь пробиотиков или соответствующее плацебо один раз в день в течение трех месяцев. Основная цель этого исследования — проверить влияние пробиотиков на периферическую иммунную систему. В качестве предварительных результатов будут отслеживаться моторные и немоторные симптомы БП, а также когнитивная функция и качество жизни в течение трехмесячного периода лечения с помощью ряда шкал клинической оценки.

Идентификация участников. Субъекты будут набраны среди пациентов с запланированными плановыми посещениями в Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Подробная информация о сопутствующих заболеваниях, текущем медикаментозном лечении и демографические данные этих субъектов будут легко доступны. Будет кратко описан дизайн испытания, и пациентов спросят об их заинтересованности в участии. Желающие субъекты примут участие в скрининговом визите, письменное информированное согласие будет получено до подтверждения права на участие.

Судебные процедуры

Клинические Во время визита при регистрации медицинское и неврологическое обследование оценит необходимость немедленных изменений в медикаментозной терапии для каждого участника. В течение двух недель любая модификация терапии будет завершена, и будет назначен исходный визит.

Во время исходного визита (T0) физические и неврологические осмотры будут повторяться для подтверждения состояния субъекта и сохранения критериев включения, будет выполнен исходный забор крови, и все шкалы клинической оценки будут заполнены для установления исходных баллов. Каждый участник, после подписания соответствующего информированного согласия, будет рандомизирован и получит лечебную коробку, содержащую однодозовые саше с 2,7 г порошка выделенной лекарственной формы. Пациенты будут проинструктированы принимать суточные дозы дома каждое утро перед завтраком, смешивая содержимое одного пакетика примерно со 125 мл пресной воды или другого холодного негазированного напитка. Участники будут проинструктированы сохранять неиспользованную или пустую упаковку на память и для оценки соответствия требованиям.

Последующие посещения будут запланированы через 4 недели после T0 (T1) и через 12 недель после T0 (T2). В Т1 будут повторены физикальное и неврологическое обследование, и снова будут введены все клинические шкалы. В Т2 все оценки, выполненные в Т0, будут проведены снова, включая забор крови.

В Т0 и Т2 забор 40 мл венозной крови будет проводиться после ночи натощак, между 8:00 и 10:00 утра, в пробирки, покрытые этилендиаминтетрауксусной кислотой (BD Vacutainer). Пробирки кодируются и хранятся при комнатной температуре до обработки в течение 24 часов. Общий анализ крови с дифференциальным анализом будет проводиться на отдельных образцах крови.

Лабораторные методы

Измерение цитокинов Возможное влияние лечения пробиотиками на воспалительный профиль будет оцениваться путем измерения в Т0 и Т2 уровней про (например, фактор некроза опухоли (TNF)-α, интерферон (IFN)-γ) и противовоспалительные цитокины (интерлейкин (IL)-10, IL-4). Аликвоты плазмы из каждого образца будут разделены и сохранены для анализа цитокинов. 2 мл свежей крови центрифугируют при 1400 g в течение 10 минут при комнатной температуре, а две аликвоты плазмы по 350 мкл каждая хранят во флаконах по 1,5 мл для анализа уровня цитокинов.

Проточная цитометрическая оценка иммунного фенотипа. Чтобы исследовать возможные изменения иммунного фенотипа, профиль как врожденного, так и адаптивного иммунитета будет углублен посредством цитофлуориметрической оценки в соответствии со стратегией, описанной Kustrimovic et al. в 2018 году и с дополнительными панелями, специально посвященными врожденному иммунитету. Будут оцениваться следующие подмножества клеток адаптивной иммунной системы: CD4+ и CD8+ Т-наивные клетки/клетки памяти, CD4+ Т-хелперные подмножества и CD4+ регуляторные Т-клетки. Кроме того, для врожденного иммунитета также будут оцениваться моноциты и клетки-естественные киллеры (NK). Сбор данных будет проводиться на проточном цитометре BD Celesta для сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) (Becton Dickinson Italy, Milan, Italy) с программным обеспечением BD FACS Diva (версия 8.0.1.1). и данные будут проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 10.7.1)

Оценка мРНК факторов транскрипции Согласно предыдущим исследованиям Кустримовича и Де Франческо, будет также исследована способность лечения пробиотиками изменять уровни мРНК основных факторов транскрипции в CD4+ Т-лимфоцитах. Положительные по CD4+ клетки будут получены с помощью РВМС, которые будут выделены из цельной крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus. После ресуспендирования остаточные загрязняющие эритроциты лизируют добавлением 10 мл лизирующего буфера ((г/л) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, ЭДТА 0,0368). Клетки дважды промывают очищенной бычьей сывороткой (PBS) путем добавления 10 мл PBS, затем центрифугируют при 300 g в течение 10 минут при комнатной температуре и ресуспендируют в 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI)/10% Fetal Bovine. Сыворотка (ФБС). Затем будет выполнен ручной подсчет клеток, чтобы установить количество реагентов для разделения CD4.

Типичные препараты РВМС содержат не менее 80% лимфоцитов. Затем Т-клетки CD4+ будут выделены из РВМС с помощью набора Dynabeads CD4 Positive Isolation. Затем не менее 50 000 отделенных CD4+ Т-клеток ресуспендируют в буфере для лизиса РНК PerfectPure (5 Prime GmbH, Гамбург, Германия), а тотальную РНК экстрагируют с помощью набора PerfectPure RNA Cell Kit™.

На полученной мРНК будет выполнена обратная транскрипция с использованием случайного праймера и набора комплементарной ДНК (кДНК) высокой емкости в режиме реального времени (RT).

ОТ-полимеразные цепные реакции (ПЦР) будут проводиться с 1 мкМ кДНК. Амплификация кДНК позволит провести анализ уровней мРНК генов факторов транскрипции TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 и NR4A2.

Состав лечения и его обоснование

Уход:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 колониеобразующих единиц (КОЕ) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 КОЕ Bifidobacterium Teenis BA02 ≥ 1 x 10^9 КОЕ Фруктоолигосахариды ФОС 2500 мг Мальтодекстрин q.s.

Плацебо:

Мальтодекстрин q.s.

Каждый состав пробиотиков содержит Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) и Bifidobacterium Teenis (BA02). В качестве пребиотического компонента добавляют фруктоолигосахариды (ФОС), а в качестве наполнителя используют мальтодекстрин.

Выбор пробиотиков для этого исследования основан на достоверных литературных данных: в частности, РВМС пациентов с БП, получавших лечение Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) показал повышенную продукцию противовоспалительного цитокина IL-10. Указанная обработка также способствовала восстановлению целостности мембраны в модели CacO2-клеток.

Все используемые пробиотики включены в «Квалифицированную презумпцию безопасности (QPS)-рекомендуемые биологические агенты, преднамеренно добавляемые в продукты питания или корма, как уведомлено Европейское управление по безопасности пищевых продуктов (EFSA) 12».

Состав плацебо состоит исключительно из мальтодекстрина.

Расчет размера выборки, анализ данных. Дизайн этого исследования носит исследовательский характер и в равной степени рандомизирован для лечения пробиотиками или плацебо. Из-за исследовательского характера предлагаемого исследования формальный расчет размера выборки строго не требуется. Таким образом, размер выборки для этого исследования был основан главным образом на предыдущих результатах другого исследования in vitro, которое дало статистически значимые результаты в небольшой когорте из 40 пациентов с БП для всех протестированных пробиотических штаммов с глобальным снижением продукции провоспалительных цитокинов и увеличением противовоспалительные цитокины. В настоящем исследовании ожидаемая выборка будет удвоена, всего 80 образцов будут собраны как в Т0, так и в Т2.

Данные предыдущего исследования in vitro были использованы для оценки ориентировочных размеров выборки для эффекта in vitro всех протестированных пробиотических штаммов, а размер выборки из 80 субъектов позволяет определить большинство тестируемых вариаций цитокинов с ожидаемой мощностью более 80%, устанавливая порог статистической значимости 0,05.

Статистический анализ собранных данных будет выполняться после оценки нормальности распределения данных и использования двустороннего t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни, в зависимости от обстоятельств, для сравнения независимых переменных. Корреляции данных будут анализироваться с помощью корреляционных тестов Пирсона или Спирмена. Дисперсионный анализ или критерий Крускала-Уоллиса будут использоваться для сравнения между более чем двумя группами, а парный t-критерий или критерий знаковых рангов Вилкоксона будет использоваться при сравнении парных групп (например, исходный уровень по сравнению с концом лечения, лечение по сравнению с плацебо). Пороги статистической значимости будут установлены в соответствии с конкретными характеристиками теста.