Effetti dei probiotici sull'immunità periferica nella malattia di Parkinson

Introduzione La malattia di Parkinson (MdP) è una malattia neurodegenerativa comune, che colpisce fino a 1-2 persone su 1000 in un dato momento. La prevalenza aumenta con l'età ed è stimata all'1% nelle persone di età superiore ai 65 anni.

Non esiste un trattamento disponibile per prevenire l'insorgenza del morbo di Parkinson o per ritardarne la progressione e la terapia è focalizzata sulla gestione dei sintomi. La somministrazione di carbidopa/levodopa consente il controllo dei sintomi motori, ma diventa meno efficace con il progredire della malattia e l'aumento delle dosi giornaliere provoca effetti collaterali più frequenti e gravi.

Il segno distintivo istopatologico del PD è la perdita di neuroni dopaminergici e l'accumulo di α-sinucleina (α-syn) nei neuroni sopravvissuti, ma la patofisiologia sottostante non è ancora chiara. È stato suggerito che i meccanismi infiammatori svolgano un ruolo di primo piano nella malattia, con uno squilibrio tra funzioni immunitarie dannose e protettive, nonché neurotossicità causata da specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Ulteriori prove evidenziano il coinvolgimento dell'immunità adattativa periferica nel PD, riportando uno squilibrio nelle sottopopolazioni di cellule T e nell'espressione di fattori trascrizionali nelle cellule T CD4+ nei pazienti con PD.

In questi pazienti, i sintomi non motori possono precedere l'insorgenza di una malattia clinicamente accertata.

L'eziopatogenesi del PD è ancora sconosciuta, ma il lavoro seminale di Braak et al. ipotizzarono un'iniziale aggregazione di α-syn nell'intestino con successiva propagazione lungo il nervo vago fino al cervello, raggiungendo infine la substantia nigra nel mesencefalo.

È interessante notare che, in un modello murino di PD con sovraespressione di α-syn, l'assenza di microbiota intestinale ha impedito sia l'attivazione della microglia che la compromissione motoria, indicando così un ruolo fondamentale dell'intestino e del microbiota nella patogenesi e nello sviluppo del PD.

In un recente articolo, Magistrelli et al. confermato che i probiotici possono influenzare il sistema immunitario periferico. In particolare, nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PMBC) di una coorte di pazienti PD, i probiotici sono stati in grado di modulare la produzione di citochine verso un profilo antinfiammatorio e di ridurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Gli effetti clinici dei probiotici sono stati esplorati anche in altre condizioni patologiche. Tankou et al. somministrato VSL#3 in una coorte di 9 pazienti con sclerosi multipla, il cui sistema immunitario periferico si è spostato verso un profilo antinfiammatorio, con una tendenza inversa dopo l'interruzione di VSL#3. Questi risultati sono stati confermati anche dallo stesso gruppo dopo la somministrazione di un mix di probiotici (quattro ceppi di Lactobacillus e tre ceppi di Bifidobacterium).

Alla luce di queste prove, i ricercatori hanno progettato uno studio clinico controllato randomizzato il cui obiettivo principale è verificare se i probiotici possono influenzare il sistema immunitario periferico in una coorte di pazienti con PD. Lo scopo del protocollo è quello di evidenziare i cambiamenti nei livelli di acido ribonucleico messaggero dei fattori trascrizionali (mRNA), nelle sottopopolazioni di linfociti (Th1, Th2, Th17 e Treg), nei livelli di citochine e nella produzione di ROS.

Metodi e analisi Questo studio esplorativo è uno studio in doppio cieco randomizzato controllato con placebo per valutare l'efficacia dei probiotici nella modulazione del sistema immunitario periferico nei soggetti con malattia di Parkinson. I partecipanti saranno randomizzati in due gruppi comparabili e trattati con una miscela di probiotici o placebo corrispondente una volta al giorno per tre mesi. L'obiettivo primario di questo studio è verificare gli effetti dei probiotici sul sistema immunitario periferico. Come risultati esplorativi, saranno monitorati i sintomi motori e non motori del PD, così come la funzione cognitiva e la qualità della vita durante il periodo di trattamento di tre mesi attraverso una selezione di scale di valutazione clinica.

Identificazione dei partecipanti I soggetti saranno reclutati tra i pazienti con visite di follow-up di routine programmate presso l'Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Saranno prontamente disponibili informazioni dettagliate sulle comorbidità, sulla terapia medica in corso e sui dati demografici di questi soggetti. Il disegno dello studio sarà brevemente delineato e ai pazienti verrà chiesto del loro interesse a partecipare. I soggetti disponibili parteciperanno a una visita di screening, il consenso informato scritto sarà ottenuto prima di confermare l'idoneità.

Procedure processuali

Clinico Durante la visita di iscrizione, l'esame medico e neurologico valuterà la necessità di variazioni immediate della terapia medica per ciascun partecipante. Entro due settimane, qualsiasi modifica della terapia sarà completata e sarà programmata la visita di base.

Durante la visita basale (T0), verranno ripetuti gli esami fisici e neurologici per confermare le condizioni del soggetto e la persistenza dei criteri di inclusione, verrà eseguito un prelievo di sangue basale e tutte le scale di valutazione clinica saranno completate per stabilire i punteggi basali. Ogni partecipante, previa sottoscrizione di un opportuno consenso informato, verrà randomizzato e consegnato un box di trattamento, contenente bustine monodose con 2,7g di polvere della formulazione assegnata. I pazienti saranno istruiti ad assumere dosi giornaliere a casa ogni mattina prima di colazione, mescolando il contenuto di una bustina in circa 125 ml di acqua fresca o altra bevanda fredda non gassata. I partecipanti saranno istruiti a conservare gli imballaggi inutilizzati o vuoti per la raccolta e la valutazione della conformità.

Le visite di follow-up saranno programmate a 4 settimane dopo T0 (T1) ea 12 settimane dopo T0 (T2). A T1, l'esame fisico e neurologico verrà ripetuto e tutte le scale cliniche saranno nuovamente somministrate. Al T2 verranno effettuate nuovamente tutte le valutazioni effettuate al T0, compreso il prelievo di sangue.

A T0 e T2, il prelievo di 40 ml di sangue venoso verrà eseguito dopo una notte di digiuno, tra le 8:00 e le 10:00, in provette rivestite con acido etilendiamminotetraacetico (BD Vacutainer). I tubi saranno codificati e conservati a temperatura ambiente fino alla lavorazione, entro 24 ore. L'emocromo completo con analisi differenziale sarà condotto su campioni di sangue separati.

Metodi di laboratorio

Misura delle citochine La possibile influenza del trattamento probiotico sul profilo infiammatorio sarà valutata misurando a T0 e T2 i livelli plasmatici di pro (es. Fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, Interferone (IFN)-γ) e citochine antinfiammatorie (Interleuchina (IL)-10, IL-4). Le aliquote di plasma di ciascun campione saranno separate e conservate per i saggi delle citochine. 2 mL di sangue fresco saranno centrifugati a 1400g per 10 minuti a temperatura ambiente e due aliquote di plasma da 350 µL ciascuna saranno conservate in fiale da 1,5mL per saggiare i livelli di citochine.

Valutazione citofluorimetrica del fenotipo immunitario Al fine di indagare possibili cambiamenti nel fenotipo immunitario, il profilo dell'immunità sia innata che adattativa sarà approfondito mediante una valutazione citofluorimetrica secondo la strategia descritta da Kustrimovic et al. nel 2018 e con ulteriori panel mirati specificamente dedicati all'immunità innata. Saranno valutati i seguenti sottoinsiemi cellulari del sistema immunitario adattativo: cellule CD4+ e CD8+ T naïve/memoria, sottoinsiemi CD4+ T helper e cellule T regolatorie CD4+. Inoltre, per l'immunità innata, saranno valutati anche i monociti e le cellule Natural Killer (NK). L'acquisizione sarà eseguita su un citometro a flusso BD Fluorescence-activated cell sorting (FACS) Celesta (Becton Dickinson Italia, Milano, Italia) con il software BD FACS Diva (versione 8.0.1.1) e i dati saranno analizzati con il software FlowJo (versione 10.7.1)

Valutazione dell'mRNA dei fattori trascrizionali In base a precedenti studi di Kustrimovic e De Francesco, sarà anche studiata la capacità del trattamento probiotico di modificare i livelli di mRNA dei principali fattori trascrizionali nei linfociti T CD4+. Cellule CD4+ positive saranno ottenute mediante PBMC, che saranno isolate dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Paque Plus. Dopo la risospensione, gli eritrociti contaminanti residui saranno lisati mediante l'aggiunta di 10 mL di tampone di lisi ((g/L) NH4Cl 8.248, KHCO3 1.0, EDTA 0.0368). Le cellule saranno lavate due volte in Purified Bovine Serum (PBS) mediante l'aggiunta di 10 mL di PBS, quindi centrifugate a 300 g per 10 min a temperatura ambiente e risospese in 10 mL di Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/10% Fetal Bovine Siero (FBS). Verrà quindi eseguito il conteggio manuale delle cellule per impostare le quantità dei reagenti di separazione CD4.

Le tipiche preparazioni di PBMC conterranno almeno l'80% di linfociti. Le cellule T CD4+ saranno quindi isolate dalle PBMC mediante il kit Dynabeads CD4 Positive Isolation. Almeno 50.000 cellule T CD4+ separate saranno quindi risospese nel tampone di lisi dell'RNA PerfectPure (5 Prime GmbH, Amburgo, Germania) e l'RNA totale sarà estratto dal PerfectPure RNA Cell Kit™.

La trascrizione inversa sarà eseguita sull'mRNA risultante utilizzando un primer casuale e un kit complementare DNA (cDNA) Real Time (RT) ad alta capacità.

Le reazioni a catena della RT-polimerasi (PCR) saranno eseguite con 1 μM di cDNA. L'amplificazione del cDNA consentirà l'analisi dei livelli di mRNA dei geni del fattore di trascrizione TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 e NR4A2.

Composizione e razionale del trattamento

Trattamento:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Unità Formanti Colonia (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Frutto-oligosaccaridi FOS 2500 mg Maltodestrina q.b.

Placebo:

Maltodestrina q.b.

Ogni formulazione di probiotici contiene Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) e Bifidobacterium adolescentis (BA02). I frutto-oligosaccaridi (FOS) vengono aggiunti come componente prebiotico e la maltodestrina viene utilizzata come agente di carica.

La scelta dei probiotici per questo studio si basa su solidi dati di letteratura: in particolare PBMC di pazienti PD trattati con Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) ha mostrato un aumento della produzione della citochina antinfiammatoria IL-10. Detto trattamento ha anche supportato il ripristino dell'integrità della membrana in un modello di cellule CacO2.

Tutti i probiotici utilizzati sono inclusi negli "agenti biologici raccomandati per la presunzione qualificata di sicurezza (QPS) aggiunti intenzionalmente ad alimenti o mangimi come notificato all'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) 12".

La formulazione placebo è composta esclusivamente da maltodestrina.

Calcolo della dimensione del campione, analisi dei dati Il disegno di questo studio è esplorativo e ugualmente randomizzato al trattamento con probiotici o placebo. A causa della natura esplorativa dello studio proposto, non è strettamente necessario un calcolo formale della dimensione del campione. La dimensione del campione per questo studio si è quindi basata principalmente sui risultati precedenti di un altro studio in vitro, che ha prodotto risultati statisticamente significativi in ​​una piccola coorte di 40 pazienti PD per tutti i ceppi probiotici testati, con una riduzione globale della produzione di citochine proinfiammatorie e un aumento della citochine antinfiammatorie. Nel presente studio, il campione previsto sarà raddoppiato, con un totale di 80 campioni da raccogliere sia a T0 che a T2.

I dati di precedenti studi in vitro sono stati utilizzati per stimare le dimensioni del campione orientativo per l'effetto in vitro di tutti i ceppi probiotici testati e una dimensione del campione di 80 soggetti consente la determinazione della maggior parte delle variazioni di citochine testate con una potenza prevista superiore all'80%, impostando la soglia per la significatività statistica a 0,05.

L'analisi statistica sui dati raccolti sarà eseguita dopo aver valutato la normalità della distribuzione dei dati e utilizzando il test t di Student a due code o il test di Mann-Whitney, a seconda dei casi, per il confronto di variabili indipendenti. Le correlazioni dei dati saranno analizzate attraverso i test di correlazione di Pearson o Spearman. ANOVA o i test di Kruskal-Wallis verranno utilizzati per i confronti tra più di due gruppi e il t-test appaiato o il test dei ranghi con segno di Wilcoxon verranno utilizzati quando si confrontano gruppi appaiati (ad es. basale vs fine trattamento, trattamento vs placebo). Le soglie per la significatività statistica saranno fissate in base alle caratteristiche specifiche del test.