파킨슨병에서 말초 면역에 대한 프로바이오틱스의 효과

소개 파킨슨병(PD)은 일반적인 신경변성 질환으로, 주어진 시간에 1000명 중 1-2명에게 영향을 미칩니다. 유병률은 나이가 들수록 증가하며 65세 이상에서는 1%로 추정됩니다.

PD 발병을 예방하거나 진행을 지연시킬 수 있는 치료법이 없으며 치료는 증상 관리에 중점을 둡니다. 카비도파/레보도파 투여로 운동 증상을 조절할 수 있지만 질병이 진행됨에 따라 효과가 떨어지고 일일 복용량을 늘리면 더 빈번하고 심각한 부작용이 발생합니다.

PD의 조직병리학적 특징은 살아남은 뉴런에서 도파민성 뉴런의 손실 및 α-시누클레인(α-syn)의 축적이지만 근본적인 병리생리학은 여전히 ​​불분명합니다. 염증 메커니즘은 해로운 면역 기능과 보호 면역 기능 사이의 불균형과 반응성 산소 종(ROS)에 의한 신경 독성과 함께 질병에서 두드러진 역할을 하는 것으로 제안되었습니다.

추가 증거는 PD 환자의 CD4+ T 세포에서 전사 인자의 발현과 T 세포 하위 집단의 불균형을 보고하는 PD에서의 말초 적응 면역의 관련성을 강조합니다.

이 환자들에서 비운동 증상은 임상적으로 확립된 질병의 발병에 선행할 수 있습니다.

PD의 병인은 아직 알려지지 않았지만 Braak et al. 장에서 α-syn의 초기 응집과 미주 신경을 따라 뇌로의 후속 전파가 최종적으로 중뇌의 흑질에 도달한다고 가정했습니다.

흥미롭게도 PD의 α-syn 과발현 뮤린 모델에서 장내 미생물의 부재는 미세아교세포 활성화와 운동 손상을 방지하여 PD의 병인 및 발달에서 장과 미생물의 근본적인 역할을 지적합니다.

최근 논문에서 Magistrelli et al. 프로바이오틱스가 말초 면역 체계에 영향을 미칠 수 있음을 확인했습니다. 특히, PD 환자 코호트의 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)에서 프로바이오틱스는 사이토카인 생성을 항염 프로필로 조절하고 반응성 산소종(ROS) 생성을 감소시킬 수 있었습니다. 프로바이오틱스의 임상 효과는 다른 병리학적 상태에서도 연구되었습니다. Tankouet al. 9명의 다발성 경화증 환자 코호트에 VSL#3을 투여했는데, 그의 말초 면역 체계는 VSL#3 중단 후 반대 경향으로 항염증 프로파일로 이동했습니다. 이러한 결과는 프로바이오틱스(락토바실러스 4종 및 비피도박테리움 3종) 혼합 투여 후 동일한 그룹에서도 확인되었습니다.

이 증거에 비추어 조사자들은 프로바이오틱스가 PD 환자 코호트에서 말초 면역 체계에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트하는 것이 주요 목적인 무작위 통제 임상 시험을 설계했습니다. 프로토콜의 목적은 전사 인자 메신저 리보핵산(mRNA) 수준, 림프구 하위 집단(Th1, Th2, Th17 및 Treg), 사이토카인 수준 및 ROS 생산의 변화를 강조하는 것입니다.

방법 및 분석 이 탐색적 연구는 파킨슨병 환자의 말초 면역 체계를 조절하는 프로바이오틱스의 효능을 평가하기 위한 무작위 위약 대조 이중 맹검 연구입니다. 참가자는 비교 가능한 두 그룹으로 무작위 배정되어 3개월 동안 매일 1회 프로바이오틱스 또는 일치하는 위약의 혼합물로 치료를 받습니다. 이 연구의 주요 목적은 프로바이오틱스가 말초 면역 체계에 미치는 영향을 확인하는 것입니다. 탐색적 결과로서 파킨슨병의 운동 및 비운동 증상은 물론 임상 평가 척도를 선택하여 3개월 치료 기간 동안 인지 기능 및 삶의 질을 모니터링합니다.

참가자 식별 피험자는 Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara에서 예정된 정기 후속 방문을 가진 환자 중에서 모집됩니다. 동반이환에 대한 자세한 정보, 현재의 의료 요법 및 이러한 피험자의 인구통계학적 데이터를 쉽게 이용할 수 있습니다. 실험 설계에 대해 간략히 설명하고 환자에게 참여에 대한 관심을 질문합니다. 자발적인 피험자는 스크리닝 방문에 참석하고 적격성을 확인하기 전에 사전 서면 동의를 얻습니다.

재판 절차

임상 등록 방문 중에 의료 및 신경학적 검사를 통해 각 참가자에 대한 의료 요법의 즉각적인 변화가 필요한지 평가합니다. 2주 이내에 모든 치료 수정이 완료되고 기본 방문 일정이 잡힙니다.

기준선 방문(T0) 동안, 피험자의 상태 및 포함 기준의 지속성을 확인하기 위해 신체 및 신경학적 검사를 반복하고, 기준선 혈액 회수를 수행하고 모든 임상 평가 척도를 완료하여 기준선 점수를 설정합니다. 각 참가자는 적절한 정보에 입각한 동의를 받은 후 무작위로 배정되어 할당된 제형의 분말 2.7g이 들어 있는 단일 용량 주머니가 들어 있는 치료 상자를 받게 됩니다. 환자는 매일 아침 아침 식사 전에 집에서 매일 복용량을 복용하도록 지시받으며 약 125ml의 담수 또는 기타 차가운 비 탄산 음료에 한 봉지의 내용물을 혼합합니다. 참가자는 기억 및 준수 평가를 위해 사용하지 않았거나 빈 포장재를 보관하도록 지시받습니다.

후속 방문은 T0(T1) 후 4주 및 T0(T2) 후 12주에 예정될 것입니다. T1에서 신체 및 신경학적 검사를 반복하고 모든 임상 척도를 다시 시행합니다. T2에서 T0에서 수행된 모든 평가는 채혈을 포함하여 다시 수행됩니다.

T0 및 T2에서 에틸렌디아민테트라아세트산으로 코팅된 튜브(BD Vacutainer)에서 금식 후 밤 8시에서 10시 사이에 정맥혈 40ml를 채취합니다. 튜브는 24시간 이내에 처리될 때까지 코딩되고 실온에서 보관됩니다. 감별 분석을 통한 전체 혈구 수는 별도의 혈액 샘플에서 수행됩니다.

실험실 방법

사이토카인 측정 염증 프로필에 대한 프로바이오틱 치료의 가능한 영향은 T0 및 T2에서 프로의 혈장 수준을 측정하여 평가됩니다(예: 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터페론(IFN)-γ) 및 항염증 사이토카인(인터류킨(IL)-10, IL-4). 모든 샘플의 혈장 분취량은 사이토카인 분석을 위해 분리되어 저장됩니다. 2mL의 신선한 혈액을 실온에서 10분 동안 1400g에서 원심분리하고 각각 350μL의 2개의 혈장 분취량을 1.5mL 바이알에 저장하여 사이토카인 수준을 분석합니다.

면역 표현형의 유세포 분석 평가 면역 표현형의 가능한 변화를 조사하기 위해 Kustrimovic et al. 2018년에는 특히 선천적 면역에 전념하는 추가 패널이 있습니다. 적응 면역 시스템의 다음 세포 서브셋이 평가될 것입니다: CD4+ 및 CD8+ T 순진/기억 세포, CD4+ T 헬퍼 서브셋 및 CD4+ 조절 T 세포. 또한, 선천 면역을 위해 단핵구 및 자연 살해(NK) 세포도 평가됩니다. 수집은 BD FACS Diva 소프트웨어(버전 8.0.1.1)를 사용하여 BD FACS(Fluorescence-activated cell sorting) Celesta 유세포 분석기(Becton Dickinson Italy, Milan, Italy)에서 수행됩니다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어(버전 10.7.1)로 분석됩니다.

전사 인자 mRNA 평가 Kustrimovic 및 De Francesco의 이전 연구에 따르면, CD4+ T 림프구에서 주요 전사 인자의 mRNA 수준을 수정하는 프로바이오틱 처리의 능력도 조사될 것입니다. CD4+ 양성 세포는 PBMC에 의해 얻어지며 Ficoll-Paque Plus 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전혈에서 분리됩니다. 재현탁 후 잔류 오염 적혈구는 용해 완충액((g/L) NH4Cl 8.248, KHCO3 1.0, EDTA 0.0368) 10mL를 첨가하여 용해됩니다. 세포는 10mL의 PBS를 첨가하여 정제 소 혈청(PBS)에서 두 번 세척한 다음 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리하고 10mL의 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI)/10% 태아 소에 재현탁합니다. 혈청(FBS). 그런 다음 수동 세포 계수를 수행하여 CD4 분리 시약 수량을 설정합니다.

전형적인 PBMC 제제는 적어도 80% 림프구를 함유할 것이다. 그런 다음 Dynabeads CD4 양성 분리 키트를 사용하여 CD4+ T 세포를 PBMC에서 분리합니다. 그런 다음 최소 50,000개의 분리된 CD4+ T 세포를 PerfectPure RNA 용해 완충액(5 Prime GmbH, Hamburg, Germany)에 재현탁하고 전체 RNA를 PerfectPure RNA Cell Kit™로 추출합니다.

무작위 프라이머 및 고용량 상보적 DNA(cDNA) 실시간(RT) 키트를 사용하여 생성된 mRNA에 대해 역전사를 수행합니다.

RT-중합 효소 연쇄 반응(PCR)은 1 μM cDNA로 수행됩니다. cDNA의 증폭은 전사 인자 유전자 TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 및 NR4A2의 mRNA 수준 분석을 허용합니다.

치료 구성 및 근거

치료:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 집락 형성 단위(CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium youth BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fructo-oligosaccharides FOS 2500 mg Maltodextrin q.s.

위약:

말토덱스트린 q.s.

각 프로바이오틱스 제형에는 Bifidobacterium animalis subsp가 포함되어 있습니다. lactis(BS01), 비피도박테리움 롱검(BL03) 및 비피도박테리움 틴에이디스(BA02). Fructo-oligosaccharides (FOS)는 prebiotical 성분으로 첨가되고 maltodextrin은 증량제로 사용됩니다.

이 연구를 위한 프로바이오틱스의 선택은 견고한 문헌 데이터, 특히 Bifidobacterium animalis subsp로 치료받은 PD 환자의 PBMC를 기반으로 합니다. Lactis(BS01)는 항염증성 사이토카인 IL-10의 생산 증가를 보여주었습니다. 상기 처리는 또한 CacO2-세포 모델에서 막 무결성의 회복을 지원하였다.

사용된 모든 프로바이오틱스는 "유럽식품안전청(EFSA) 12에 통보된 대로 식품 또는 사료에 의도적으로 첨가된 QPS(Qualified Presumption of Safety) 권장 생물학적 제제"에 포함됩니다.

위약 제제는 말토덱스트린으로만 구성됩니다.

샘플 크기 계산, 데이터 분석 이 연구의 설계는 탐색적이며 프로바이오틱스 또는 위약 치료에 동등하게 무작위화됩니다. 제안된 연구의 탐색적 특성으로 인해 공식적인 표본 크기 계산이 엄격하게 요구되지는 않습니다. 따라서 이 연구의 샘플 크기는 다른 체외 연구의 이전 결과에 주로 기반을 두었습니다. 이 연구는 40명의 PD 환자로 구성된 작은 코호트에서 테스트한 모든 프로바이오틱 균주에 대해 통계적으로 유의미한 결과를 얻었으며 전 염증성 사이토카인 생산의 전반적인 감소와 항염증성 사이토카인. 본 연구에서는 예상 샘플이 두 배가 되어 T0과 T2 모두에서 총 80개의 표본이 수집될 것입니다.

이전 체외 연구의 데이터는 시험된 모든 프로바이오틱 균주의 시험관 내 효과에 대한 오리엔테이션 샘플 크기를 추정하는 데 사용되었으며 80명의 피험자 샘플 크기는 80%보다 큰 예상 검정력으로 대부분의 테스트된 사이토카인 변이를 결정할 수 있도록 합니다. 통계적 유의성에 대한 임계값은 0.05입니다.

수집된 데이터에 대한 통계 분석은 데이터 분포의 정규성을 평가하고 독립변수 비교에 적합한 양측 스튜던트 t 테스트 또는 맨-휘트니 테스트를 사용하여 수행됩니다. 데이터 상관 관계는 Pearson 또는 Spearman의 상관 관계 테스트를 통해 분석됩니다. ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트는 2개 이상의 그룹 간의 비교에 사용되며 쌍을 이룬 그룹을 비교할 때는 쌍 t-테스트 또는 Wilcoxon 부호 순위 검정이 사용됩니다(예: 기준선 대 치료 종료, 치료 대 위약). 통계적 유의성에 대한 임계값은 특정 테스트 특성에 따라 설정됩니다.