益生菌对帕金森病外周免疫的影响

简介 帕金森氏病 (PD) 是一种常见的神经退行性疾病，在任何特定时间影响 1000 人中多达 1-2 人。 患病率随着年龄的增长而增加，在 65 岁以上的人群中患病率估计为 1%。

没有可用的治疗方法来预防 PD 发作或延缓其进展，治疗主要集中在症状管理上。 卡比多巴/左旋多巴的给药可以控制运动症状，但随着疾病的进展，它变得不那么有效，并且增加每日剂量会导致更频繁和更严重的副作用。

PD 的组织病理学标志是多巴胺能神经元的丢失和存活神经元中 α-突触核蛋白 (α-syn) 的积累，但潜在的病理生理学仍不清楚。 炎症机制被认为在该疾病中起着重要作用，有害和保护性免疫功能之间的不平衡，以及活性氧 (ROS) 引起的神经毒性。

进一步的证据强调了 PD 中外周适应性免疫的参与，报告了 PD 患者中 T 细胞亚群和 CD4+ T 细胞中转录因子表达的不平衡。

在这些患者中，非运动症状可能先于临床确定的疾病发作。

PD 的发病机制仍然未知，但 Braak 等人的开创性工作。假设 α-syn 在肠道中最初聚集，随后沿着迷走神经传播到大脑，最终到达中脑的黑质。

有趣的是，在 α-syn 过表达的 PD 小鼠模型中，肠道微生物群的缺失阻止了小胶质细胞的激活和运动损伤，从而表明肠道和微生物群在 PD 的发病机制和发展中起着重要作用。

在最近的一篇论文中，Magistrelli 等人。证实益生菌可能影响外周免疫系统。 特别是，在一组 PD 患者的外周血单核细胞 (PMBC) 中，益生菌能够调节细胞因子的产生以达到抗炎作用，并减少活性氧 (ROS) 的产生。 益生菌的临床效果也在其他病理条件下得到了探索。 Tankou 等人。在一组 9 名多发性硬化症患者中施用 VSL#3，其外周免疫系统转向抗炎特性，在 VSL#3 停药后具有相反的趋势。 这些结果在服用混合益生菌（四种乳酸杆菌和三种双歧杆菌）后也得到了同一组的证实。

鉴于这一证据，研究人员设计了一项随机对照临床试验，其主要目的是测试益生菌是否可以影响一组 PD 患者的外周免疫系统。 该协议的目的是突出转录因子信使核糖核酸 (mRNA) 水平、淋巴细胞亚群 (Th1、Th2、Th17 和 Treg)、细胞因子水平和 ROS 产生的变化。

方法和分析 这项探索性研究是一项随机安慰剂对照双盲研究，旨在评估益生菌在调节帕金森病受试者外周免疫系统方面的功效。 参与者将被随机分为两个可比较的组，并接受益生菌混合物或匹配的安慰剂治疗，每天一次，持续三个月。 本研究的主要目的是验证益生菌对外周免疫系统的影响。 作为探索性结果，将通过一系列临床评定量表监测 PD 的运动和非运动症状，以及三个月治疗期间的认知功能和生活质量。

参与者识别 受试者将在 Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara 进行定期随访的患者中招募。 这些受试者的合并症、当前药物治疗和人口统计数据的详细信息将很容易获得。 将简要概述试验设计，并询问患者是否有兴趣参与。 有意愿的受试者将参加筛选访问，在确认资格之前将获得书面知情同意书。

审理程序

临床 在注册访问期间，医学和神经学检查将评估每位参与者是否需要立即改变药物治疗。 在两周内，将完成任何治疗修改并安排基线访视。

在基线访问 (T0) 期间，将重复进行身体和神经系统检查，以确认受试者的状况和纳入标准的持续性，将进行基线抽血，并完成所有临床评估量表以设定基线分数。 在签署适当的知情同意书后，每位参与者将被随机分配并获得一个治疗盒，其中包含单剂量小袋和 2.7 克分配配方的粉末。 将指导患者每天早上早餐前在家中服用每日剂量，将一小袋的内容物混合在约 125 毫升的淡水或其他冷的非碳酸饮料中。 将指示参与者保留未使用或空的包装以供回收和合规性评估。

后续访问将安排在 T0 (T1) 后 4 周和 T0 (T2) 后 12 周。 在 T1，将重复进行身体和神经系统检查，并再次执行所有临床量表。 在 T2 时，将再次执行在 T0 时进行的所有评估，包括抽血。

在 T0 和 T2，将在禁食一夜后，上午 8:00 和 10:00 之间，在乙二胺四乙酸涂层管（BD Vacutainer）中抽取 40 毫升静脉血。 试管将被编码并在室温下储存，直到在 24 小时内进行处理。 将对单独的血样进行全血细胞计数和差异分析。

实验室方法

细胞因子测量 益生菌治疗对炎症特征的可能影响将通过在 T0 和 T2 时测量 pro（例如 肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ）和抗炎细胞因子（白细胞介素（IL）-10、IL-4）。 来自每个样品的血浆等分试样将被分离并储存用于细胞因子测定。将 2 mL 新鲜血液在室温下以 1400 g 离心 10 分钟，并将每份 350 µL 的两份血浆等分试样储存在 1.5 mL 小瓶中以测定细胞因子水平。

免疫表型的流式细胞术评估为了研究免疫表型的可能变化，先天免疫和适应性免疫的概况将根据 Kustrimovic 等人描述的策略通过细胞荧光评估加深。 2018 年，还有专门针对先天免疫的其他小组。 适应性免疫系统的以下细胞亚群将被评估：CD4+ 和 CD8+ T 幼稚/记忆细胞、CD4+ T 辅助细胞亚群和 CD4+ 调节性 T 细胞。 此外，对于先天免疫，还将评估单核细胞和自然杀伤 (NK) 细胞。 采集将在 BD 荧光激活细胞分选 (FACS) Celesta 流式细胞仪（Becton Dickinson Italy，米兰，意大利）和 BD FACS Diva 软件（版本 8.0.1.1）上进行 数据将使用 FlowJo 软件（版本 10.7.1）进行分析

转录因子 mRNA 评估 根据 Kustrimovic 和 De Francesco 之前的研究，还将研究益生菌处理改变 CD4+ T 淋巴细胞中主要转录因子 mRNA 水平的能力。 CD4+ 阳性细胞将通过 PBMC 获得，使用 Ficoll-Paque Plus 密度梯度离心从全血中分离出来。 重悬后，通过添加 10 mL 裂解缓冲液（(g/L) NH4Cl 8.248、KHCO3 1.0、EDTA 0.0368）裂解残留的污染红细胞。 通过添加 10 mL PBS，将细胞在纯化牛血清 (PBS) 中洗涤两次，然后在室温下以 300 g 离心 10 分钟，并重悬于 10 mL Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI)/10% 胎牛中血清（胎牛血清）。 然后将进行手动细胞计数以设置 CD4 分离试剂的数量。

典型的 PBMC 制剂将含有至少 80% 的淋巴细胞。 然后通过 Dynabeads CD4 Positive Isolation 试剂盒从 PBMC 中分离出 CD4+ T 细胞。 然后将至少 50,000 个分离的 CD4+ T 细胞重悬于 PerfectPure RNA 裂解缓冲液（5 Prime GmbH，德国汉堡），并通过 PerfectPure RNA Cell Kit™ 提取总 RNA。

将使用随机引物和高容量互补 DNA (cDNA) 实时 (RT) 试剂盒对生成的 mRNA 进行逆转录。

将使用 1 μM cDNA 进行 RT 聚合酶链式反应 (PCR)。 cDNA 的扩增将允许分析转录因子基因 TBX21、STAT1、STAT3、STAT4、STAT6、RORC、GATA3、FOXP3 和 NR4A2 的 mRNA 水平。

治疗组合和基本原理

治疗：

动物双歧杆菌亚种 lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 菌落形成单位 (CFU) 长双歧杆菌 03 ≥ 1 x 10^9 CFU 青春双歧杆菌 BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU 低聚果糖 FOS 2500 mg 麦芽糖糊精 q.s.

安慰剂：

麦芽糖糊精适量

每个益生菌制剂都含有动物双歧杆菌亚种。 乳双歧杆菌 (BS01)、长双歧杆菌 (BL03) 和青春双歧杆菌 (BA02)。 添加低聚果糖 (FOS) 作为益生元成分，并使用麦芽糖糊精作为填充剂。

本研究益生菌的选择基于可靠的文献数据：特别是用动物双歧杆菌亚种治疗的 PD 患者的 PBMC。 Lactis (BS01) 显示抗炎细胞因子 IL-10 的产生增加。 所述处理还支持在 Caco2 细胞模型中恢复膜完整性。

使用的所有益生菌都包含在“合格安全推定 (QPS)-推荐的有意添加到食品或饲料中的生物制剂，如通知欧洲食品安全局 (EFSA) 12”。

安慰剂配方仅由麦芽糖糊精组成。

样本量计算、数据分析 本研究的设计是探索性的，同样随机分配至益生菌或安慰剂治疗。 由于拟议研究的探索性，并不严格要求进行正式的样本量计算。 因此，本研究的样本量主要基于另一项体外研究的先前结果，该研究在 40 名 PD 患者的小队列中对所有测试的益生菌菌株产生了具有统计学意义的结果，促炎细胞因子的产生在全球范围内减少，而抗炎细胞因子。 在本研究中，预期样本将增加一倍，在 T0 和 T2 收集总共 80 个标本。

先前体外研究的数据已用于估计所有测试益生菌菌株体外效应的定向样本量，80 名受试者的样本量允许确定大多数测试细胞因子变异的预期功效大于 80%，设置统计显着性的阈值为 0.05。

在评估数据分布的正态性并使用双尾学生 t 检验或适用于自变量比较的 Mann-Whitney 检验后，将对收集的数据进行统计分析。 数据相关性将通过 Pearson 或 Spearman 相关性检验进行分析。 方差分析或 Kruskal-Wallis 检验将用于两个以上组之间的比较，配对 t 检验或 Wilcoxon 符号秩检验将在比较配对组时使用（例如 基线对比治疗结束，治疗对比安慰剂）。 统计显着性的阈值将根据具体的测试特征来设置。