Effekter af probiotika på perifer immunitet ved Parkinsons sygdom

Introduktion Parkinsons sygdom (PD) er en almindelig neurodegenerativ sygdom, der rammer op til 1-2 personer ud af 1000 på ethvert givet tidspunkt. Prævalensen stiger med alderen og anslås til 1 % hos personer over 65 år.

Der er ingen tilgængelig behandling til at forhindre PD-debut eller for at forsinke dens progression, og behandlingen er fokuseret på symptomhåndtering. Administrationen af ​​carbidopa/levodopa giver mulighed for kontrol af motoriske symptomer, men den bliver mindre effektiv, efterhånden som sygdommen skrider frem, og stigende daglige doser forårsager hyppigere og alvorligere bivirkninger.

Det histopatologiske kendetegn ved PD er tabet af dopaminerge neuroner og akkumulering af α-synuclein (α-syn) i overlevende neuroner, men den underliggende patofysiologi er stadig uklar. Inflammatoriske mekanismer er blevet foreslået at spille en fremtrædende rolle i sygdommen, med en ubalance mellem skadelige og beskyttende immunfunktioner, samt neurotoksicitet forårsaget af reaktive oxygenarter (ROS).

Yderligere beviser fremhæver involveringen af ​​perifer adaptiv immunitet i PD, der rapporterer en ubalance i T-celle subpopulationer og i ekspressionen af ​​transkriptionelle faktorer i CD4+ T-celler hos PD-patienter.

Hos disse patienter kan ikke-motoriske symptomer gå forud for starten af ​​en klinisk etableret sygdom.

Etiopatogenese af PD er stadig ukendt, men banebrydende arbejde af Braak et al. hypotese en indledende aggregering af α-syn i tarmen med efterfølgende udbredelse langs vagusnerven til hjernen, til sidst at nå substantia nigra i mesencephalon.

Interessant nok forhindrede fraværet af tarmmikrobiota i en α-syn-overudtrykkende murin model af PD både mikroglia-aktivering og motorisk svækkelse, hvilket peger på en fundamental rolle for tarmen og mikrobiotaen i patogenesen og udviklingen af ​​PD.

I et nyligt papir, Magistrelli et al. bekræftet, at probiotika kan påvirke det perifere immunsystem. Især i perifere blodmononukleære celler (PMBC'er) fra en kohorte af PD-patienter var probiotika i stand til at modulere produktionen af ​​cytokiner mod en anti-inflammatorisk profil og reducere produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS). De kliniske virkninger af probiotika er også blevet undersøgt i andre patologiske tilstande. Tankou et al. administreret VSL#3 i en kohorte af 9 multipel sklerosepatienter, hvis perifere immunsystem skiftede mod en anti-inflammatorisk profil, med en omvendt tendens efter VSL#3 seponering. Disse resultater blev også bekræftet af den samme gruppe efter administration af en blanding af probiotika (fire stammer af Lactobacillus og tre stammer af Bifidobacterium).

I lyset af denne evidens udformede efterforskerne et randomiseret kontrolleret klinisk forsøg, hvis primære mål er at teste, om probiotika kan påvirke det perifere immunsystem i en kohorte af PD-patienter. Formålet med protokollen er at fremhæve ændringer i transskriptionelle faktorers budbringer Ribonukleinsyre (mRNA) niveauer, lymfocytunderpopulationer (Th1, Th2, Th17 og Treg), cytokinniveauer og ROS-produktion.

Metoder og analyser Dette eksplorative studie er et randomiseret placebo-kontrolleret dobbelt-blindt studie til at evaluere effektiviteten af ​​probiotika til at modulere det perifere immunsystem hos personer med Parkinsons sygdom. Deltagerne vil blive randomiseret i to sammenlignelige grupper og behandlet med en blanding af probiotika eller matchende placebo én gang dagligt i tre måneder. Det primære formål med denne undersøgelse er at verificere virkningerne af probiotika på det perifere immunsystem. Som udforskende resultater vil motoriske og ikke-motoriske symptomer på PD blive monitoreret, såvel som kognitiv funktion og livskvalitet over den tre måneder lange behandlingsperiode via et udvalg af kliniske vurderingsskalaer.

Deltageridentifikation. Emner vil blive rekrutteret blandt patienter med planlagte rutinemæssige opfølgningsbesøg på Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. Detaljerede oplysninger om komorbiditeter, aktuel medicinsk terapi og demografiske data for disse forsøgspersoner vil være let tilgængelige. Forsøgsdesignet vil blive kort skitseret, og patienterne vil blive spurgt om deres interesse for at deltage. Villige forsøgspersoner vil deltage i et screeningsbesøg, skriftligt informeret samtykke vil blive indhentet, før berettigelse bekræftes.

Forsøgsprocedurer

Klinisk Under indskrivningsbesøg vil medicinsk og neurologisk undersøgelse vurdere behovet for umiddelbare variationer i medicinsk terapi for hver deltager. Inden for to uger vil enhver behandlingsmodifikation være afsluttet, og baselinebesøg vil blive planlagt.

Under baseline-besøg (T0) vil fysiske og neurologiske undersøgelser blive gentaget for at bekræfte forsøgspersonens tilstand og vedholdenhed af inklusionskriterier, en baseline-blodudtagning vil blive udført, og alle kliniske evalueringsskalaer vil blive fuldført for at fastsætte baseline-scores. Hver deltager vil, efter at have tegnet et passende informeret samtykke, blive randomiseret og udleveret en behandlingsæske, der indeholder enkeltdosisposer med 2,7 g pulver af den tildelte formulering. Patienterne vil blive instrueret i at tage daglige doser derhjemme hver morgen før morgenmad, blande indholdet af en pose i ca. 125 ml frisk vand eller anden kold, ikke-kulsyreholdig drik. Deltagerne vil blive instrueret i at opbevare ubrugt eller tom emballage til erindring og overensstemmelsesevaluering.

Opfølgningsbesøg vil blive planlagt 4 uger efter T0 (T1) og 12 uger efter T0 (T2). Ved T1 vil fysisk og neurologisk undersøgelse blive gentaget og alle kliniske skalaer administreret igen. Ved T2 vil alle vurderinger, der udføres ved T0, blive foretaget igen, inklusive blodudtagning.

Ved T0 og T2 udføres udtagning af 40 ml veneblod efter en fastenat, mellem kl. 8:00 og 10:00, i ethylendiamintetraeddikesyrebelagte rør (BD Vacutainer). Rørene vil blive kodet og opbevaret ved stuetemperatur indtil behandling inden for 24 timer. Fuldstændig blodtælling med differentiel analyse vil blive udført på separate blodprøver.

Laboratoriemetoder

Cytokinmåling Den mulige indflydelse af probiotisk behandling på inflammatorisk profil vil blive evalueret ved at måle ved T0 og T2 plasmaniveauerne af pro (f.eks. Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interferon (IFN)-y) og antiinflammatoriske cytokiner (Interleukin (IL)-10, IL-4). Plasmaalikvoter fra hver prøve vil blive adskilt og opbevaret til cytokinassays. 2 ml frisk blod vil blive centrifugeret ved 1400 g i 10 minutter ved stuetemperatur, og to plasmaalikvoter på hver 350 µL vil blive opbevaret i 1,5 ml hætteglas for at analysere cytokinniveauer.

Flowcytometrisk evaluering af immunfænotype For at undersøge mulige ændringer i immunfænotype vil profilen af ​​både medfødt og adaptiv immunitet blive uddybet ved hjælp af en cytofluorimetrisk evaluering i henhold til strategien beskrevet af Kustrimovic et al. i 2018 og med yderligere paneler rettet specifikt til medfødt immunitet. Følgende celleundergrupper af det adaptive immunsystem vil blive vurderet: CD4+ og CD8+ T-naive/hukommelsesceller, CD4+ T-hjælperundersæt og CD4+ regulatoriske T-celler. Desuden vil monocytter og Natural Killer (NK) celler også blive vurderet for medfødt immunitet. Anskaffelsen vil blive udført på et BD Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) Celesta flowcytometer (Becton Dickinson Italien, Milano, Italien) med BD FACS Diva software (version 8.0.1.1) og data vil blive analyseret med FlowJo software (version 10.7.1)

Transkriptionelle faktorer mRNA-evaluering Ifølge tidligere undersøgelser af Kustrimovic og De Francesco vil probiotisk behandlings evne til at modificere mRNA-niveauer af de vigtigste transkriptionelle faktorer i CD4+ T-lymfocytter også blive undersøgt. CD4+ positive celler vil blive opnået af PBMC, som vil blive isoleret fra fuldblod ved hjælp af Ficoll-Paque Plus tæthedsgradientcentrifugering. Efter resuspension vil resterende kontaminerende erytrocytter blive lyseret ved tilsætning af 10 ml lyseringsbuffer ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Celler vil blive vasket to gange i oprenset bovint serum (PBS) ved tilsætning af 10 ml PBS, derefter centrifugeret ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur og resuspenderet i 10 ml Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)/10 % føtal bovin Serum (FBS). Manuel celletælling vil derefter blive udført for at indstille mængden af ​​CD4-separationsreagenser.

Typiske PBMC-præparater vil indeholde mindst 80% lymfocytter. CD4+ T-celler vil derefter blive isoleret fra PBMC ved hjælp af Dynabeads CD4 Positive Isolation kit. Mindst 50.000 adskilte CD4+ T-celler vil derefter blive resuspenderet i PerfectPure RNA-lysebuffer (5 Prime GmbH, Hamborg, Tyskland), og totalt RNA vil blive ekstraheret af PerfectPure RNA Cell Kit™.

Revers-transkription vil blive udført på resulterende mRNA ved hjælp af en tilfældig primer og et højkapacitets komplementært DNA (cDNA) Real Time (RT) kit.

RT-Polymerase Chain Reactions (PCR) vil blive udført med 1 μM cDNA. Amplifikation af cDNA vil muliggøre analyse af mRNA-niveauer af transkriptionsfaktorgenerne TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 og NR4A2.

Behandlingens sammensætning og begrundelse

Behandling:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Kolonidannende Enheder (CFU) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 CFU Bifidobacterium adolescentis BA02 ≥ 1 x 10^9 CFU Fructo-oligosaccharider mg Malq.500 FOS.2dextrin FOS.

Placebo:

Maltodextrin q.s.

Hver probiotikaformulering indeholder Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) og Bifidobacterium adolescentis (BA02). Fructo-oligosaccharider (FOS) tilsættes som en præbiotisk komponent, og maltodextrin anvendes som fyldstof.

Valget af probiotika til denne undersøgelse er baseret på solide litteraturdata: især PBMC fra PD-patienter behandlet med Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) viste en øget produktion af anti-inflammatorisk cytokin IL-10. Behandlingen understøttede også genoprettelse af membranintegritet i en model af CacO2-celler.

Alle anvendte probiotika er inkluderet i "Qualified Presumption of Safety (QPS)-anbefalede biologiske agenser, der bevidst er tilsat til fødevarer eller foder, som anmeldt til European Food Safety Authority (EFSA) 12".

Placeboformuleringen er udelukkende sammensat af maltodextrin.

Prøvestørrelsesberegning, dataanalyse Designet af denne undersøgelse er eksplorativt og lige randomiseret til behandling med probiotika eller placebo. På grund af den foreslåede undersøgelses eksplorative karakter er en formel stikprøvestørrelsesberegning ikke strengt påkrævet. Prøvestørrelsen for denne undersøgelse er således primært baseret på tidligere resultater fra et andet in vitro-studie, som gav statistisk signifikante resultater i en lille kohorte på 40 PD-patienter for alle testede probiotiske stammer, med en global reduktion i proinflammatorisk cytokinproduktion og en stigning i anti-inflammatoriske cytokiner. I denne undersøgelse vil den forventede prøve blive fordoblet, med i alt 80 prøver, der skal indsamles både ved T0 og T2.

Data fra tidligere in vitro-studier er blevet brugt til at estimere orienterende prøvestørrelser for in vitro-effekten af ​​alle testede probiotiske stammer, og en prøvestørrelse på 80 forsøgspersoner gør det muligt at bestemme de fleste testede cytokinvariationer med en forventet effekt større end 80 %, indstilling tærsklen for statistisk signifikans ved 0,05.

Statistisk analyse af indsamlede data vil blive udført efter at have vurderet normaliteten af ​​datafordelingen og ved at bruge to-halet Student's t-test eller Mann-Whitney-test, alt efter hvad der er passende for uafhængige variable sammenligninger. Datakorrelationer vil blive analyseret gennem Pearsons eller Spearmans korrelationstest. ANOVA eller Kruskal-Wallis testene vil blive brugt til sammenligninger mellem mere end to grupper, og parret t-test eller Wilcoxon signed ranks test vil blive brugt ved sammenligning af parrede grupper (f.eks. baseline vs afslutning af behandling, behandling vs placebo). Tærskler for statistisk signifikans vil blive fastsat i henhold til de specifikke testkarakteristika.