Efectos de los probióticos sobre la inmunidad periférica en la enfermedad de Parkinson

Introducción La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa común, que afecta hasta 1-2 personas de cada 1000 en un momento dado. La prevalencia aumenta con la edad y se estima en un 1% en personas mayores de 65 años.

No existe un tratamiento disponible para prevenir la aparición de la EP o para retrasar su progresión y la terapia se centra en el manejo de los síntomas. La administración de carbidopa/levodopa permite el control de los síntomas motores, pero se vuelve menos eficaz a medida que avanza la enfermedad y el aumento de las dosis diarias provoca efectos secundarios más frecuentes y graves.

El sello histopatológico de la EP es la pérdida de neuronas dopaminérgicas y la acumulación de α-sinucleína (α-syn) en las neuronas sobrevivientes, pero la fisiopatología subyacente aún no está clara. Se ha sugerido que los mecanismos inflamatorios desempeñan un papel destacado en la enfermedad, con un desequilibrio entre las funciones inmunitarias perjudiciales y protectoras, así como la neurotoxicidad causada por las especies reactivas del oxígeno (ROS).

Más evidencia destaca la participación de la inmunidad adaptativa periférica en la EP, informando un desequilibrio en las subpoblaciones de células T y en la expresión de factores transcripcionales en las células T CD4+ en pacientes con EP.

En estos pacientes, los síntomas no motores pueden preceder a la aparición de una enfermedad clínicamente establecida.

Todavía se desconoce la etiopatogenia de la EP, pero el trabajo seminal de Braak et al. planteó la hipótesis de una agregación inicial de α-syn en el intestino con una propagación posterior a lo largo del nervio vago hasta el cerebro, alcanzando finalmente la sustancia negra en el mesencéfalo.

Curiosamente, en un modelo murino de EP que sobreexpresa α-syn, la ausencia de microbiota intestinal impidió tanto la activación de la microglía como el deterioro motor, lo que apunta a un papel fundamental del intestino y la microbiota en la patogenia y el desarrollo de la EP.

En un artículo reciente, Magistrelli et al. confirmó que los probióticos pueden influir en el sistema inmunitario periférico. En particular, en las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) de una cohorte de pacientes con EP, los probióticos pudieron modular la producción de citoquinas hacia un perfil antiinflamatorio y reducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los efectos clínicos de los probióticos también se han explorado en otras condiciones patológicas. Tankou et al. administró VSL#3 en una cohorte de 9 pacientes con esclerosis múltiple, cuyo sistema inmunológico periférico cambió hacia un perfil antiinflamatorio, con una tendencia inversa después de la interrupción de VSL#3. Estos resultados también fueron confirmados por el mismo grupo tras la administración de una mezcla de probióticos (cuatro cepas de Lactobacillus y tres cepas de Bifidobacterium).

A la luz de esta evidencia, los investigadores diseñaron un ensayo clínico controlado aleatorizado cuyo objetivo principal es probar si los probióticos pueden influir en el sistema inmunitario periférico en una cohorte de pacientes con EP. El objetivo del protocolo es resaltar los cambios en los niveles de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de los factores transcripcionales, las subpoblaciones de linfocitos (Th1, Th2, Th17 y Treg), los niveles de citoquinas y la producción de ROS.

Métodos y análisis Este estudio exploratorio es un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo para evaluar la eficacia de los probióticos en la modulación del sistema inmunitario periférico en sujetos con enfermedad de Parkinson. Los participantes serán aleatorizados en dos grupos comparables y tratados con una mezcla de probióticos o un placebo equivalente una vez al día durante tres meses. El objetivo principal de este estudio es verificar los efectos de los probióticos en el sistema inmunológico periférico. Como resultados exploratorios, se controlarán los síntomas motores y no motores de la EP, así como la función cognitiva y la calidad de vida durante el período de tratamiento de tres meses a través de una selección de escalas de calificación clínica.

Identificación de los participantes Los sujetos se reclutarán entre los pacientes con visitas de seguimiento de rutina programadas en la Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della Carità di Novara. La información detallada sobre las comorbilidades, la terapia médica actual y los datos demográficos de estos sujetos estarán fácilmente disponibles. Se describirá brevemente el diseño del ensayo y se preguntará a los pacientes sobre su interés en participar. Los sujetos dispuestos asistirán a una visita de selección, se obtendrá el consentimiento informado por escrito antes de confirmar la elegibilidad.

Procedimientos de prueba

Clínico Durante la visita de inscripción, el examen médico y neurológico evaluará la necesidad de variaciones inmediatas en la terapia médica para cada participante. Dentro de dos semanas, se completará cualquier modificación de la terapia y se programará la visita inicial.

Durante la visita inicial (T0), se repetirán los exámenes físicos y neurológicos para confirmar las condiciones del sujeto y la persistencia de los criterios de inclusión, se realizará una extracción de sangre inicial y se completarán todas las escalas de evaluación clínica para establecer puntuaciones iniciales. Cada participante, después de la suscripción de un consentimiento informado apropiado, será aleatorizado y se le entregará una caja de tratamiento que contiene sobres monodosis con 2,7 g de polvo de la formulación asignada. Se indicará a los pacientes que tomen las dosis diarias en casa todas las mañanas antes del desayuno, mezclando el contenido de un sobre en unos 125 ml de agua fresca u otra bebida fría sin gas. Se indicará a los participantes que conserven los envases sin usar o vacíos para su recolección y evaluación del cumplimiento.

Las visitas de seguimiento se programarán a las 4 semanas después de T0 (T1) ya las 12 semanas después de T0 (T2). En T1, se repetirá el examen físico y neurológico y se administrarán nuevamente todas las escalas clínicas. En T2, todas las evaluaciones realizadas en T0 se realizarán nuevamente, incluida la extracción de sangre.

En T0 y T2, se realizará la extracción de 40 ml de sangre venosa después de una noche de ayuno, entre las 8:00 y las 10:00 horas, en tubos recubiertos con ácido etilendiaminotetraacético (BD Vacutainer). Los tubos se codificarán y almacenarán a temperatura ambiente hasta su procesamiento, dentro de las 24 horas. Se realizará un hemograma completo con análisis diferencial en muestras de sangre separadas.

Métodos de laboratorio

Medición de citocinas La posible influencia del tratamiento con probióticos en el perfil inflamatorio se evaluará midiendo en T0 y T2 los niveles plasmáticos de pro (p. Factor de Necrosis Tumoral (TNF)-α, Interferón (IFN)-γ) y Citocinas antiinflamatorias (Interleucina (IL)-10, IL-4). Las alícuotas de plasma de cada muestra se separarán y almacenarán para los ensayos de citoquinas. Se centrifugarán 2 ml de sangre fresca a 1400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenarán dos alícuotas de plasma de 350 µl cada una en viales de 1,5 ml para analizar los niveles de citoquinas.

Evaluación por citometría de flujo del fenotipo inmune Con el fin de investigar posibles cambios en el fenotipo inmune, se profundizará en el perfil de la inmunidad tanto innata como adaptativa mediante una evaluación citofluorimétrica según la estrategia descrita por Kustrimovic et al. en 2018 y con paneles adicionales destinados específicamente a la inmunidad innata. Se evaluarán los siguientes subconjuntos de células del sistema inmunitario adaptativo: células T ingenuas/de memoria CD4+ y CD8+, subconjuntos de células T auxiliares CD4+ y células T reguladoras CD4+. Además, para la inmunidad innata, también se evaluarán los monocitos y las células asesinas naturales (NK). La adquisición se realizará en un citómetro de flujo Celesta BD Fluorescence-activated cell sorting (FACS) (Becton Dickinson Italia, Milán, Italia) con el software BD FACS Diva (versión 8.0.1.1) y los datos se analizarán con el software FlowJo (versión 10.7.1)

Evaluación de ARNm de factores transcripcionales De acuerdo con estudios previos de Kustrimovic y De Francesco, también se investigará la capacidad del tratamiento con probióticos para modificar los niveles de ARNm de los principales factores transcripcionales en los linfocitos T CD4+. Las células CD4+ positivas se obtendrán mediante PBMC, que se aislarán de la sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque Plus. Después de la resuspensión, los eritrocitos contaminantes residuales se lisarán mediante la adición de 10 ml de tampón de lisis ((g/L) NH4Cl 8,248, KHCO3 1,0, EDTA 0,0368). Las células se lavarán dos veces en suero bovino purificado (PBS) mediante la adición de 10 ml de PBS, luego se centrifugarán a 300 g durante 10 min a temperatura ambiente y se resuspenderán en 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)/bovino fetal al 10 %. Suero (FBS). A continuación, se realizará el recuento manual de células para establecer las cantidades de reactivos de separación de CD4.

Las preparaciones típicas de PBMC contendrán al menos un 80 % de linfocitos. Luego, las células T CD4+ se aislarán de las PBMC por medio del kit Dynabeads CD4 Positive Isolation. A continuación, se resuspenderán al menos 50 000 linfocitos T CD4+ separados en el tampón de lisis PerfectPure RNA (5 Prime GmbH, Hamburgo, Alemania) y el PerfectPure RNA Cell Kit™ extraerá el ARN total.

La transcripción inversa se realizará en el ARNm resultante utilizando un cebador aleatorio y un kit en tiempo real (RT) de ADN complementario (ADNc) de alta capacidad.

Las reacciones en cadena de la RT-polimerasa (PCR) se realizarán con ADNc 1 μM. La amplificación del ADNc permitirá el análisis de los niveles de ARNm de los genes del factor de transcripción TBX21, STAT1, STAT3, STAT4, STAT6, RORC, GATA3, FOXP3 y NR4A2.

Composición y justificación del tratamiento

Tratamiento:

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BS01 ≥ 1 x 10^9 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) Bifidobacterium longum 03 ≥ 1 x 10^9 UFC Bifidobacterium teenageris BA02 ≥ 1 x 10^9 UFC Fructooligosacáridos FOS 2500 mg Maltodextrina c.s.p.

Placebo:

Maltodextrina c.s.p.

Cada formulación de probióticos contiene Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BS01), Bifidobacterium longum (BL03) y Bifidobacterium adolescencia (BA02). Se añaden fructooligosacáridos (FOS) como componente prebiótico y se utiliza maltodextrina como agente de carga.

La elección de los probióticos para este estudio se basa en datos sólidos de la literatura: en particular, PBMC de pacientes con EP tratados con Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BS01) mostró una mayor producción de citocina antiinflamatoria IL-10. Dicho tratamiento también apoyó la restauración de la integridad de la membrana en un modelo de células CacO2.

Todos los probióticos utilizados están incluidos en la "Presunción cualificada de seguridad (QPS)-agentes biológicos recomendados agregados intencionalmente a alimentos o piensos según lo notificado a la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) 12".

La formulación de placebo está compuesta únicamente por maltodextrina.

Cálculo del tamaño de la muestra, análisis de datos El diseño de este estudio es exploratorio e igualmente aleatorizado al tratamiento con probióticos o placebo. Debido a la naturaleza exploratoria del estudio propuesto, no se requiere estrictamente un cálculo formal del tamaño de la muestra. El tamaño de la muestra para este estudio se ha basado principalmente en resultados previos de otro estudio in vitro, que arrojó resultados estadísticamente significativos en una pequeña cohorte de 40 pacientes con EP para todas las cepas probióticas probadas, con una reducción global en la producción de citocinas proinflamatorias y un aumento en citocinas antiinflamatorias. En el presente estudio se duplicará la muestra esperada, con un total de 80 especímenes a recolectar tanto en T0 como en T2.

Se han utilizado datos de estudios in vitro anteriores para estimar tamaños de muestra orientativos para el efecto in vitro de todas las cepas probióticas probadas y un tamaño de muestra de 80 sujetos permite la determinación de la mayoría de las variaciones de citoquinas probadas con una potencia esperada superior al 80 %, estableciendo el umbral de significación estadística en 0,05.

El análisis estadístico de los datos recopilados se realizará después de evaluar la normalidad de la distribución de datos y usar la prueba t de Student de dos colas o la prueba de Mann-Whitney, según corresponda, para las comparaciones de variables independientes. Las correlaciones de datos se analizarán a través de las pruebas de correlación de Pearson o Spearman. ANOVA o las pruebas de Kruskal-Wallis se usarán para comparaciones entre más de dos grupos y se usará la prueba t pareada o la prueba de rangos con signo de Wilcoxon cuando se comparen grupos pareados (p. línea de base frente al final del tratamiento, tratamiento frente a placebo). Los umbrales de significación estadística se establecerán de acuerdo con las características específicas de la prueba.