COVID-19 検出のためのマルチプレックス BangasureTM RT-PCR キットの有効性 (COVID-19)

序章：

新型コロナウイルス COVID-19 のパンデミックは、私たちの時代を定義する世界的な健康危機であり、第二次世界大戦以降に直面した最大の課題です。 パンデミックは単なる健康危機以上のものです。それはまた、前例のない社会経済的危機でもあります。 中国の武漢地域で確認されて以来、ウイルスは 213 の国/地域に広がり、2 億 900 万件の症例と世界全体で 439 万件に上っただけでなく、国際労働機関の推定によると 4 億人が職を失う可能性があります。

病気の蔓延を封じ込めるために、社会的距離の実施、個人の衛生状態の維持、接触者の追跡、検疫の実施、旅行制限、ロックダウンなど、世界のさまざまな地域で学際的な戦略が開始されています。 広く受け入れられている方法は、通常、鼻咽頭スワブ検体を利用する SARS-CoV-2 の検査です。 陽性と判定された患者は、軽度の症状の場合は自宅で、中等度から重度の症状の場合は医療施設内で効果的な隔離または検疫による適切な臨床管理が必要です。 さらに、大規模なテストは、病気の監視と制御に関するポリシーを起草するためのより有益な疫学的データを提供します。 鼻咽頭液中の SARS-CoV-2 ウイルスを検出するために、マルチプレックス RT-PCR、CRISPR/Cas12、CRISPR-Cas3、ラテラル フロー イムノアッセイ、紙ベースの 2 分子センサー、ワンポットでの SHERLOCK テスト、DNA アプタマーなど、多くのアプローチが提案されています。 、ループ媒介等温増幅（LAMP）など。 これらの方法の中で、核酸増幅ベースの検査は、SARS-CoV-2 の診断に最も一般的です。

さらに、米国 CDC は、ヌクレオキャプシド遺伝子の 2 つの領域、すなわち N1 と N2、およびヒトの内部制御遺伝子 RNase P (RP) の増幅に基づいて、SARS-CoV-2 を検出するためのプロトコルを提案しています。 これらの戦略に加えて、より少ない反応時間と労力で、効率と精度の高い SARS-CoV-2 検出方法を開発する取り組みが現在も進行中です。

しかし、SARS CoV-2 検出のゴールド スタンダードと見なされているにもかかわらず、さまざまな要因により多くの国で検査が遅れをとっています。最も重要なのは、試薬と適切な検査キットが不足しているというサプライ チェーンの問題です。 そのため、多くの患者（症状のある人も無症状の人も）は検査を受けていないままであり、ウイルスのコミュニティへの拡散に寄与している可能性があります。

バングラデシュが独自の RT-PCR キットを製造できれば、感度、特異性などの点で品質が劣らず、RT-PCR キットの不足が緩和されます。研究者は輸入された検査キットに完全に依存しており、外貨も節約できるからです。 さらに、RT-PCR テスト キットは非常に温度に敏感であり、その品質のためにコールド チェーンを維持する必要があります。これは、ローカル RT PCR キットを開発することで軽減できます。 さらに、突然変異によりSARS-CoV-2の多くのバリアントが開発されており、より病原性が高く、感染率が高いことが示されています。 したがって、より新しい菌株を検出できる新しい RT PCR キットの開発は非常に役立ちます。

したがって、ここでの研究者の目的は、国初となる 3 つの遺伝子検出可能な堅牢な RT-PCR キットを開発し、SARS-CoV-2 ウイルスのさまざまな種類のバリアントの信頼できる結果を提供して、その伝染性を低下させ、予防管理計画を立てることです。研究：

1. 一般的な目的: 主な目的は、SARS-CoV-2 を検出するための多重リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (rRT-PCR) を開発することです。

2. 副次的な目的: 最高の RT-PCR パフォーマンスを得るには、E および N 遺伝子ターゲットの組み合わせを最適化する必要があります。

   3. 方法論: 3.1. 研究の種類と目的: これは症例対照研究と観察研究であり、凍結サンプルと新鮮サンプルの 2 つの既存グループを特定して比較します。

   3.2.研究の場所:

   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR)
   • MS。臨床研究機構株式会社 3.3。 サンプル収集サイト:
   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) または
   • 国立検査医学研究所および照会センター (NILMRC)、ダッカ、バングラデシュ。

   3.4。 研究期間： •バングラデシュ医学研究評議会から倫理的許可を得てから3か月（2021年11月から2022年1月まで）。

   3.5。 調査母集団/サンプル選択 3.5.1 CRO は、IEDCR からテスト サンプルを受け取ります。 IEDCR と CRO としての BCTL/CROL は、さまざまな共同研究作業について覚書 (MoU) を締結しています。 したがって、NILMRC/BCTL/CROL は、RT-PCR キットの効率を評価するために IEDCR から合計 120 のサンプルを受け取ります。 120 のサンプルのうち、60 は IEDCR 施設で -80°C のラボ用冷凍庫に保管されたサンプル (30 の COVID-19 既知の陽性および 30 の COVID-19 陰性サンプル) と別の 60 の新鮮な検体 (30 の COVID-19 陽性) に保存されます。 IEDCRでテストされている30のCOVID-19陰性サンプル）。 結果が一致しないサンプルは、BRiCM RT PCR キットでテストする前に拒否されます。 つまり、インポートされた RT-PCR キットと抽出キットを BCTL/CROL で分析するには、IEDCR から特定された 120 を超えるサンプルが必要になる場合があります。 これは、BRiCM RT-PCR キットの性能評価のために 120 のサンプルが選択される方法です。

   3.5.2 偏見と利益相反を避けるために、スポンサーとPI /共同研究者は、サンプルIDとサンプルの陽性/陰性ステータス、および患者の臨床記録を知らされません。 保存されたサンプルと新鮮なサンプルの両方の陽性/陰性ステータスは、BCTL/CROL に送信される前に IEDCR で識別されます。 つまり、BCTL/CROL 担当者は、分析前にサンプルの ID 文書 (ID) とポジティブ ネガティブ/ネガティブ ステータスについても知らされません。 最後に、CRO 責任者は業績評価証明書を PI またはスポンサーに送信します。

   3.5.3. サンプルサイズの統計的根拠:

   式:

   この研究は 120 人の参加者 (60 人の保存された既知の陽性および陰性と 60 人の新鮮な既知の陽性および陰性) に対して実施されます。 RT-PCR の効率を推定する際に必要な絶対精度 (n) を達成するために、次の離散ベルヌーイ確率関数に従って最小サンプル サイズを推定します。

   Alfa= 5% D= 95% の信頼度での絶対精度 (%)。 望ましい絶対精度 n D α=5% Z=1.96 10 30.99% n D= (1.96)/(2* 平方根 (SQRT) (n)) 20 21.91% 100 9.80% 30 17.89% 120 8.94% 100 9.80% 200 6.93% 300 5.66% 400 4.90% 1000 3.10% 10000 0.98% 20000 0.69% 30000 0.57% 100000 0.3% 3.6 サンプルの選択基準IEDCR の遺伝子は COVID-19 陽性として選択されます。 IEDCR で COVID-19 遺伝子の増幅がなく、RT-PCR の結果が陰性であるサンプルは、COVID-19 として選択されます。

   • 性別: すべて
   • 年齢: 5 歳から 70 歳 (子供、大人、高齢者) 7.8.2. 除外基準
   • シグモイド曲線と Ct 値に関してあいまい/あいまいな RT-PCR の結果を持つサンプルは除外されます。

   CRO は IEDCR との MOU に従って IEDCR から検体を受け取るため、患者からの同意は必要ありません。 したがって、CRO 側からの患者の登録と同意、および CRF の要件はありません。

   3.7 データ収集手順: COVID-19 陽性サンプルは、ウイルス RNA の陽性 RT-PCR 結果の検査所見によって確認されます。

   3.8 データ解析: BRiCM COVID-19 リアルタイム RT-PCR キットの感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率が決定されます。 カテゴリー変数を比較するために、カイ二乗検定 (両側) が実行されます。 ≤0.05 の p 値は、有意な関連のレベルと見なされます。 感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率に加えて、カッパ係数、陽性尤度比、陰性尤度比も計算されます。

   3.9 データベースは、確立されたセキュリティ手順によって不正アクセスから保護されています。データベースおよび関連するソフトウェア ファイルの適切なバックアップ コピーを維持する必要があります。 データベースは、データベースの更新または変更と併せて、データベース管理者によってバックアップされます。

   3.10 治験責任医師は、モニターおよび権限を与えられた代表者が研究データにアクセスできるようにしなければなりません。 治験責任医師は、治験責任医師に 3 か月ごとに中間調査報告書とデータを提供する必要があります。 要件に応じて、調査レポートとデータはバングラデシュ医学研究評議会 (BMRC) および医薬品管理総局 (DGDA) に提供される場合があります。 治験責任医師は、ソース文書の信頼性と可用性を確保する必要があります。

   3.11 モニタリング訪問は、治験責任医師、共同治験責任医師、および代表者によって、適正臨床実践ガイドライン (GCP) に従って実施されます。

   3.12 被験者の機密性を維持するために、サイト番号、被験者番号、および被験者のイニシャルのみが、症例記録フォーム (CRF) および治験責任医師に提出されるその他の文書ですべての被験者を識別します。 追加の被験者の守秘義務の問題 (該当する場合) は、臨床研究契約に記載されています。

   3.13 すべての記録は、責任者である IEDCR 責任者を除き、PI、共同研究者、スポンサーに対して秘密にされます。 サンプルは、BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) に送付する前に、IEDCR でコード/ID 番号および日付として識別されます。臨床試験を実施して、既存のリソースを通じてキットの有効性を確認します。 それに加えて、資金提供機関間のMoUに従って、研究に必要な場合、CROは化学物質、試薬、および技術を管理できます。

   5. 利益相反 BRiCM は提案された COVID-19 RT-PCR キットの資金提供機関であり、科学技術省の行政管理下で機能する法定機関です。 これは、化学測定の分野における研究機関および参照機関です。 営利企業でも営利団体でもありません。 憲法上の制裁によると、BRiCM の主な責任は、人々の福祉を確保するための政府の取り組みに価値を付加する革新につながる研究を続けることです。