Efficacia di un kit Multiplex BangasureTM RT-PCR per il rilevamento di COVID-19 (COVID-19)

Introduzione:

La pandemia del virus corona COVID-19 è la crisi sanitaria globale che definisce il nostro tempo e la più grande sfida che hanno dovuto affrontare dalla seconda guerra mondiale. La pandemia è molto più di una crisi sanitaria; è anche una crisi socio-economica senza precedenti. Dalla sua identificazione nella regione di Wuhan, in Cina, non solo il virus si è diffuso in 213 paesi/territori con 209 milioni di casi e 4,39 milioni a livello globale, ma potrebbe anche far perdere il lavoro a 400 milioni di persone, secondo le stime dell'Organizzazione internazionale del lavoro.

Per contenere la diffusione della malattia, sono state lanciate strategie multidisciplinari in diverse regioni del mondo, tra cui l'implementazione del distanziamento sociale, il mantenimento dell'igiene personale, il tracciamento dei contatti e l'implementazione della quarantena, delle restrizioni di viaggio e dei blocchi. Un metodo ampiamente accettato è il test per SARS-CoV-2, in genere utilizzando campioni di tampone nasofaringeo. I pazienti risultati positivi richiedono un'appropriata gestione clinica mediante isolamento efficace o quarantena a casa per sintomi lievi o all'interno di strutture sanitarie per sintomi da moderati a gravi. Inoltre, i test su larga scala forniscono dati epidemiologici più informativi per l'elaborazione di politiche sul monitoraggio e il controllo delle malattie. Sono stati proposti molti approcci per rilevare il virus SARS-CoV-2 nei fluidi rinofaringei come multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 e CRISPR-Cas3, immunodosaggio a flusso laterale, sensori bimolecolari cartacei, test SHERLOCK in un vaso, aptamero del DNA , amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), ecc. Tra questi metodi, i test basati sull'amplificazione dell'acido nucleico sono i più comuni per la diagnosi di SARS-CoV-2.

Inoltre, il CDC statunitense suggerisce un protocollo per il rilevamento di SARS-CoV-2, basato sull'amplificazione di due regioni del gene del nucleocapside, vale a dire N1 e N2, e un gene di controllo interno umano RNase P (RP). Oltre a queste strategie, sono ancora in corso gli sforzi per sviluppare metodi di rilevamento SARS-CoV-2 con elevata efficienza e precisione, con tempi e sforzi di reazione ridotti.

Tuttavia, nonostante sia considerato il gold standard per il rilevamento di SARS CoV-2, i test sono rimasti indietro in molti paesi a causa di vari fattori, il più importante dei quali sono i problemi della catena di approvvigionamento con la mancanza di reagenti e kit di test adeguati. Pertanto, molti pazienti (sia sintomatici che asintomatici) rimangono non testati e quindi contribuiscono potenzialmente alla diffusione del virus nella comunità.

Se il Bangladesh fosse in grado di produrre i propri kit RT-PCR che non sono di qualità inferiore in termini di sensibilità, specificità ecc., ciò mitigherebbe la carenza di kit RT-PCR poiché gli investigatori dipendono totalmente dai kit di test importati e risparmiano anche valuta estera. Inoltre, i kit di test RT-PCR sono molto sensibili alla temperatura e devono mantenere la catena del freddo per la sua qualità che può essere mitigata sviluppando un kit RT PCR locale. Inoltre, molte varianti di SARS-CoV-2 sono state sviluppate a causa della mutazione, che ha mostrato maggiore virulenza e un'elevata velocità di trasmissione. Pertanto, lo sviluppo di un nuovo kit RT PCR in grado di rilevare i ceppi più recenti può essere estremamente utile.

Quindi, qui l'obiettivo del ricercatore è sviluppare il kit RT-PCR robusto rilevabile a tre geni che sarà il primo paese e fornirà risultati affidabili su diversi tipi di variante del virus SARS-CoV-2 per ridurne la trasmissibilità e adottare il piano di gestione preventiva 2. Obiettivi di lo studio:

1. Obiettivi generali: gli obiettivi primari mirano a sviluppare la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa multiplex in tempo reale (rRT-PCR) per rilevare SARS-CoV-2.

2. Obiettivi secondari: per le migliori prestazioni RT-PCR, la combinazione dei bersagli genici E e N dovrebbe essere ottimizzata.

   3. Metodologia: 3.1. Tipo e scopo dello studio: si tratta di uno studio caso-controllo e osservazionale in cui vengono identificati e confrontati due gruppi esistenti di campioni congelati e campioni freschi.

   3.2. Luogo di studio:

   • Istituto per il controllo e la ricerca delle malattie in epidemiologia (IEDCR)
   • SM. Organizzazione per la ricerca clinica Ltd 3.3. Sito/i di raccolta dei campioni:
   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) o
   • Istituto nazionale di medicina di laboratorio e centro di riferimento (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Durata dello studio: • 3 mesi (da novembre 2021 a gennaio 2022) dopo aver ottenuto l'autorizzazione etica dal Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Popolazione dello studio/selezione del campione 3.5.1 Il CRO riceverà campioni di test da IEDCR. IEDCR e BCTL/CROL come CRO hanno memorandum d'intesa (MoU) per diversi lavori di ricerca in collaborazione. Pertanto, NILMRC/BCTL/CROL riceverà un totale di 120 campioni da IEDCR per la valutazione dell'efficienza del kit RT-PCR. Dei 120 campioni, 60 saranno conservati (30 positivi al COVID-19 e 30 negativi al COVID-19) che sono stati conservati in congelatori da laboratorio a -80°C presso le strutture IEDCR e altri 60 campioni freschi (30 positivi al COVID-19) e 30 campioni negativi al COVID-19) che sono in fase di test presso IEDCR. I campioni con risultati discordanti verranno rifiutati prima del test con il kit BRiCM RT PCR. Ciò significa che potrebbero essere necessari più di 120 campioni identificati da IEDCR per l'analisi con kit RT-PCR importati e kit di estrazione presso BCTL/CROL. In questo modo verranno selezionati 120 campioni per la valutazione delle prestazioni del kit BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Per evitare pregiudizi e conflitti di interesse, sponsor e PI/co-ricercatori saranno all'oscuro dell'ID del campione e dello stato positivo/negativo dei campioni e delle cartelle cliniche dei pazienti. Lo stato positivo/negativo dei campioni conservati e freschi sarà identificato presso IEDCR prima dell'invio a BCTL/CROL. Cioè, anche il personale BCTL/CROL sarà cieco per campionare il documento di identità (ID) e lo stato negativo/negativo positivo prima dell'analisi. Infine, il responsabile della CRO invierà il certificato di valutazione delle prestazioni al PI o allo Sponsor.

   3.5.3. Base statistica della dimensione del campione:

   Formule:

   Lo studio è condotto su 120 partecipanti (60 positivi e negativi noti memorizzati e 60 positivi e negativi noti freschi). Per ottenere l'accuratezza assoluta desiderata (n) nella stima dell'efficienza di RT-PCR, la dimensione minima del campione stimata seguendo la funzione di probabilità discreta di Bernoulli come segue:

   Alfa= 5% D= Accuratezza assoluta (%) con confidenza del 95%. Precisione assoluta desiderata n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Radice quadrata (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 8,94% 100 9,80% 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% 3.6 Criteri di selezione del campione geni presso IEDCR saranno selezionati come COVID-19 positivi. I campioni con risultati RT-PCR negativi senza amplificazione per i geni COVID-19 presso IEDCR saranno selezionati come COVID-19.

   • Sesso: tutti
   • Età: da 5 a 70 anni (Bambino, Adulto, Anziano) 7.8.2. Criteri di esclusione
   • Saranno esclusi i campioni con risultati RT-PCR equivoci/ambigui in termini di curva sigmoidale e valore Ct.

   Non è richiesto il consenso dei pazienti perché la CRO riceverà i campioni da IEDCR come da MOU con IEDCR. Quindi non vi è alcun obbligo di iscrizione del paziente e consensi e CRF dal lato CRO.

   3.7 Procedura di raccolta dati: i campioni positivi al COVID-19 saranno confermati dai risultati di laboratorio dei risultati RT-PCR positivi per l'RNA virale.

   3.8 Analisi dei dati: saranno determinati la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo e il valore predittivo negativo del kit RT-PCR in tempo reale BRiCM COVID-19. Il test chi-quadro (a due code) sarà eseguito per confrontare variabili categoriali. Un valore p di ≤0,05 sarà considerato come il livello di associazione significativa. Oltre a sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e valore predittivo negativo, verranno calcolati anche il coefficiente Kappa, il rapporto di verosimiglianza positivo e il rapporto di verosimiglianza negativo.

   3.9 La banca dati è salvaguardata da accessi non autorizzati mediante procedure di sicurezza stabilite; devono essere mantenute opportune copie di backup del database e dei relativi file software. I database vengono sottoposti a backup dall'amministratore del database insieme a eventuali aggiornamenti o modifiche al database.

   3.10 Lo sperimentatore deve rendere accessibili i dati dello studio al monitor e ai rappresentanti autorizzati. Lo sperimentatore deve fornire al ricercatore principale un rapporto di studio intermedio con i dati ogni tre mesi. Secondo i requisiti, il rapporto di studio e i dati possono essere forniti al Bangladesh Medical Research Council (BMRC) e alla Direzione generale dell'amministrazione dei farmaci (DGDA). L'investigatore deve garantire l'affidabilità e la disponibilità dei documenti originali.

   3.11 Le visite di monitoraggio saranno condotte dal ricercatore principale, dal co-investigatore e dai rappresentanti secondo le linee guida per la buona pratica clinica (GCP).

   3.12 Al fine di mantenere la riservatezza del soggetto, solo il numero del sito, il numero del soggetto e le iniziali del soggetto identificheranno tutti i soggetti dello studio sui Case Records Forms (CRF) e su altra documentazione presentata allo sperimentatore. Ulteriori problemi di riservatezza del soggetto (se applicabile) sono trattati nell'Accordo sullo studio clinico.

   3.13 Tutti i registri saranno tenuti segreti per il PI, i co-investigatori, lo sponsor ad eccezione delle persone responsabili IEDCR che sono incaricate. I campioni saranno identificati come codice/numero ID e data presso IEDCR prima dell'invio a BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Per questo studio il citato istituto IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. ha la capacità di condurre la sperimentazione clinica per scoprire l'efficacia del kit attraverso la loro risorsa esistente. Inoltre, il CRO può gestire la sostanza chimica, il reagente e la tecnologia, se necessario per lo studio, come da protocollo d'intesa tra le agenzie di finanziamento.

   5. Conflitto di interessi BRiCM è l'agenzia finanziatrice del kit COVID-19 RT-PCR proposto, è un organismo statutario che opera sotto il controllo amministrativo del Ministero della Scienza e della Tecnologia. È un ente di ricerca e un istituto di riferimento nel campo delle misure chimiche. Non è né un'impresa commerciale né un'organizzazione a scopo di lucro. Secondo la sanzione costituzionale la principale responsabilità di BRiCM è quella di portare avanti la ricerca che porti a tale innovazione che aggiungerà valore allo sforzo del governo per garantire il benessere delle persone.