Werkzaamheid van een Multiplex BangasureTM RT-PCR-kit voor de detectie van COVID-19 (COVID-19)

Invoering:

De COVID-19-pandemie van het coronavirus is de bepalende wereldwijde gezondheidscrisis van onze tijd en de grootste uitdaging sinds de Tweede Wereldoorlog. De pandemie is veel meer dan een gezondheidscrisis; het is ook een ongekende sociaal-economische crisis. Sinds de identificatie in de regio Wuhan, China, heeft het virus zich niet alleen verspreid over 213 landen/gebieden met 209 miljoen gevallen en 4,39 miljoen wereldwijd, maar zou het ook 400 miljoen mensen hun baan kunnen ontnemen, zoals de Internationale Arbeidsorganisatie schat.

Om de verspreiding van ziekten in te dammen, zijn in verschillende delen van de wereld multidisciplinaire strategieën gelanceerd, waaronder het implementeren van sociale afstand, het handhaven van persoonlijke hygiëne, het opsporen van contacten en het implementeren van quarantaine, reisbeperkingen en lock-downs. Een algemeen aanvaarde methode is het testen op SARS-CoV-2, meestal met behulp van nasofaryngeale uitstrijkjes. Patiënten die positief zijn getest, hebben passend klinisch management nodig door ofwel effectieve isolatie of quarantaine thuis voor milde symptomen of in zorginstellingen voor matige tot ernstige symptomen. Bovendien leveren grootschalige tests meer informatieve epidemiologische gegevens op voor het opstellen van beleid voor ziektemonitoring en -bestrijding. Er zijn veel benaderingen voorgesteld om het SARS-CoV-2-virus in nasofaryngeale vloeistoffen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 en CRISPR-Cas3, laterale flow-immunoassay, op papier gebaseerde bimoleculaire sensoren, SHERLOCK-testen in één pot, DNA-aptameer , lus-gemedieerde isotherme versterking (LAMP), enz. Van deze methoden zijn op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde tests de meest gebruikelijke voor de diagnose van SARS-CoV-2.

Bovendien stelt de Amerikaanse CDC een protocol voor de detectie van SARS-CoV-2 voor, gebaseerd op de amplificatie van twee regio's van het nucleocapside-gen, namelijk N1 en N2, en een menselijk intern controlegen RNase P (RP). Naast deze strategieën zijn er nog steeds inspanningen om SARS-CoV-2-detectiemethoden te ontwikkelen met hoge efficiëntie en nauwkeurigheid, met minder reactietijd en inspanning.

Ondanks dat het wordt beschouwd als de gouden standaard voor SARS CoV-2-detectie, is het testen in veel landen achtergebleven vanwege verschillende factoren, waarvan de belangrijkste problemen met de toeleveringsketen zijn met een gebrek aan reagentia en adequate testkits. Daarom blijven veel patiënten (zowel symptomatisch als asymptomatisch) niet getest en dragen dus mogelijk bij aan de verspreiding van het virus in de gemeenschap.

Als Bangladesh zijn eigen RT-PCR-kits kan produceren die qua kwaliteit niet minder zijn in termen van gevoeligheid, specificiteit enz., dan zou dat het tekort aan RT-PCR-kits verminderen, aangezien onderzoekers volledig afhankelijk zijn van geïmporteerde testkits en ook buitenlandse valuta besparen. Bovendien zijn RT-PCR-testkits zeer temperatuurgevoelig en moeten ze de koelketen behouden vanwege de kwaliteit ervan, wat kan worden verminderd door een lokale RT-PCR-kit te ontwikkelen. Bovendien zijn er veel varianten van SARS-CoV-2 ontwikkeld als gevolg van mutatie, die meer virulentie en een hoge overdrachtssnelheid heeft aangetoond. Dus de ontwikkeling van een nieuwe RT PCR-kit die nieuwere stammen kan detecteren, kan buitengewoon nuttig zijn.

Het doel van de onderzoeker is dus om de drie genen detecteerbare robuuste RT-PCR-kit te ontwikkelen die als eerste in het land zal worden uitgevoerd en een betrouwbaar resultaat zal opleveren van verschillende soorten varianten van het SARS-CoV-2-virus voor het verminderen van de overdraagbaarheid ervan en het nemen van een preventief beheersplan 2. Doelstellingen van de studie:

1. Algemene doelstellingen: Primaire doelstellingen zijn gericht op het ontwikkelen van multiplex real-time reverse transcriptie polymerase kettingreactie (rRT-PCR) om SARS-CoV-2 te detecteren.

2. Secundaire doelstellingen: Voor de beste RT-PCR-prestaties moet de combinatie van E- en N-gendoelen worden geoptimaliseerd.

   3. Methodologie: 3.1. Onderzoekstype en doel: Dit is een case-control en observationeel onderzoek waarin twee bestaande groepen ingevroren en verse monsters worden geïdentificeerd en vergeleken.

   3.2. Waar je studeert:

   • Instituut Epidemiologie Ziektebestrijding en Onderzoek (IEDCR)
   • MEVR. Clinical Research Organization Ltd 3.3. Plaats(en) voor het verzamelen van monsters:
   • Instituut Epidemiologie Disease Control and Research (IEDCR) of
   • Nationaal Instituut voor Laboratoriumgeneeskunde & Verwijzingscentrum (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Duur van de studie: • 3 maanden (november 2021 tot januari 2022) na het verkrijgen van ethische toestemming van de Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Onderzoekspopulatie/steekproefselectie 3.5.1 CRO ontvangt testmonsters van IEDCR. IEDCR en BCTL/CROL hebben als CRO een memorandum van overeenstemming (MoU) voor verschillende gezamenlijke onderzoekswerkzaamheden. NILMRC/BCTL/CROL ontvangt dus in totaal 120 monsters van IEDCR voor de evaluatie van de efficiëntie van de RT-PCR-kit. Van de 120 monsters zullen er 60 opgeslagen monsters zijn (30 COVID-19 bekende positieve en 30 COVID-19 negatieve monsters) die zijn bewaard bij -80°C laboratoriumvriezers in IEDCR-faciliteiten en nog eens 60 verse monsters (30 COVID-19 positieve monsters). en 30 COVID-19 negatieve monsters) die worden getest bij IEDCR. Monsters met tegenstrijdige resultaten worden afgekeurd voordat ze worden getest met de BRiCM RT PCR-kit. Dat wil zeggen, er kunnen meer dan 120 geïdentificeerde monsters van IEDCR nodig zijn om te analyseren door middel van geïmporteerde RT-PCR-kits en extractiekit bij BCTL/CROL. Op deze manier worden 120 monsters geselecteerd voor prestatie-evaluatie van de BRiCM RT-PCR-kit.

   3.5.2 Om vooringenomenheid en belangenverstrengeling te voorkomen, zullen sponsor en PI/co-onderzoekers blind zijn voor de monster-ID en positieve/negatieve status van de monsters en klinische dossiers van de patiënten. De positieve/negatieve status van zowel opgeslagen als verse monsters wordt geïdentificeerd bij IEDCR voordat ze naar BCTL/CROL worden verzonden. Dat wil zeggen, BCTL/CROL-personeel zal ook blind zijn voor het nemen van monsters van het identiteitsdocument (ID) en de positieve negatieve/negatieve status voorafgaand aan de analyse. Ten slotte stuurt het CRO-hoofd het prestatiebeoordelingscertificaat naar de PI of sponsor.

   3.5.3. Statistische basis van steekproefomvang:

   formules:

   De studie wordt uitgevoerd op 120 deelnemers (60 opgeslagen bekende positieve & negatieve en 60 nieuwe bekende positieve & negatieve). Om de gewenste absolute nauwkeurigheid (n) te bereiken bij het schatten van de efficiëntie van RT-PCR, wordt de minimale steekproefomvang geschat door de Discrete Bernoulli-kansfunctie als volgt te volgen:

   Alfa= 5% D= absolute Nauwkeurigheid (%) met 95% zekerheid. Gewenste absolute nauwkeurigheid n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Vierkantswortel (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 8,94% 100 9,80% 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% genen bij IEDCR zullen worden geselecteerd als COVID-19-positief. Monsters met negatieve RT-PCR-resultaten zonder amplificatie voor de COVID-19-genen bij IEDCR worden geselecteerd als COVID-19.

   • Geslacht: Alle
   • Leeftijd: 5 tot 70 jaar (kind, volwassene, oudere volwassene) 7.8.2. Uitsluitingscriteria
   • Monsters met twijfelachtige/dubbelzinnige RT-PCR-resultaten in termen van sigmoïdale curve en Ct-waarde worden uitgesloten.

   Toestemming van de patiënten is niet vereist omdat de CRO de monsters van IEDCR ontvangt volgens MOU met IEDCR. Er is dus geen vereiste van inschrijving en toestemming van de patiënt en CRF van de CRO-kant.

   3.7 Gegevensverzamelingsprocedure: COVID-19-positieve monsters zullen worden bevestigd door laboratoriumbevindingen van positieve RT-PCR-resultaten voor het virale RNA.

   3.8 Gegevensanalyse: De sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde van de BRiCM COVID-19 realtime RT-PCR-kit zullen worden bepaald. De chikwadraattoets (tweezijdig) wordt uitgevoerd om categorische variabelen te vergelijken. Een p-waarde van ≤0,05 wordt beschouwd als het niveau van significante associatie. Naast sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde, worden ook Kappa-coëfficiënt, positieve waarschijnlijkheidsratio en negatieve waarschijnlijkheidsratio berekend.

   3.9 De database wordt beveiligd tegen ongeoorloofde toegang door vastgestelde beveiligingsprocedures; Er worden passende reservekopieën van de database en gerelateerde softwarebestanden bijgehouden. Databases worden geback-upt door de databasebeheerder in combinatie met eventuele updates of wijzigingen in de database.

   3.10 De Onderzoeker dient onderzoeksgegevens toegankelijk te maken voor de monitor en gemachtigden. De onderzoeker moet om de drie maanden een tussentijds onderzoeksrapport met gegevens aan de hoofdonderzoeker verstrekken. Volgens de vereisten kunnen het onderzoeksrapport en de gegevens worden verstrekt aan de Bangladesh Medical Research Council (BMRC) en het directoraat-generaal Drug Administration (DGDA). De Onderzoeker dient zorg te dragen voor de betrouwbaarheid en beschikbaarheid van brondocumenten.

   3.11 Monitoringbezoeken zullen worden uitgevoerd door de hoofdonderzoeker, de medeonderzoeker en de vertegenwoordigers volgens de richtlijnen voor goede klinische praktijken (GCP).

   3.12 Om de vertrouwelijkheid van de proefpersoon te behouden, zullen alleen een locatienummer, proefpersoonnummer en proefpersooninitialen alle proefpersonen identificeren op Case Records Forms (CRF) en andere documentatie die aan de onderzoeker wordt voorgelegd. Aanvullende vertrouwelijkheidskwesties van het onderwerp (indien van toepassing) worden behandeld in de Klinische Studieovereenkomst.

   3.13 Alle records worden geheim gehouden voor de PI, mede-onderzoekers, sponsor behalve IEDCR-verantwoordelijke personen die de leiding hebben. Monsters zullen worden geïdentificeerd als code/ID-nummer en datum bij IEDCR voordat ze worden verzonden naar BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Voor deze studie heeft het genoemde instituut IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. de mogelijkheid om voer de klinische proef uit om de werkzaamheid van de kit te achterhalen via hun bestaande bron. Daarnaast kan CRO de chemische stof, het reagens en de technologie beheren, indien nodig voor de studie, volgens MoU tussen financieringsinstanties.

   5. Belangenverstrengeling BRiCM is de financieringsinstantie van de voorgestelde COVID-19 RT-PCR-kit, is een statutaire instantie die functioneert onder de administratieve controle van het Ministerie van Wetenschap en Technologie. Het is een onderzoeksorganisatie en een referentie-instituut op het gebied van chemische metingen. Het is noch een commerciële onderneming, noch een organisatie met winstoogmerk. Volgens de grondwet is de belangrijkste verantwoordelijkheid van BRiCM het voortzetten van onderzoek dat leidt tot innovatie die waarde toevoegt aan de inspanningen van de overheid om het welzijn van de mensen te waarborgen.