Účinnost sady Multiplex BangasureTM RT-PCR pro detekci COVID-19 (COVID-19)

Úvod:

Pandemie koronaviru COVID-19 je určující globální zdravotní krizí naší doby a největší výzvou, které jsme čelili od druhé světové války. Pandemie je mnohem víc než jen zdravotní krize; je to také bezprecedentní socioekonomická krize. Od své identifikace v regionu Wuhan v Číně se virus nejen rozšířil do 213 zemí/území s 209 miliony případů a 4,39 milionu na celém světě, ale také by mohl připravit o práci 400 milionů lidí, jak odhaduje Mezinárodní organizace práce.

Aby se zabránilo šíření nemocí, byly v různých oblastech světa zahájeny multidisciplinární strategie, včetně zavádění sociálního odstupu, udržování osobní hygieny, sledování kontaktů a zavádění karantény, cestovních omezení a uzamčení. Široce přijímanou metodou je testování na SARS-CoV-2, typicky za použití vzorků výtěrů z nosohltanu. Pacienti pozitivně testovaní vyžadují vhodnou klinickou péči buď účinnou izolací nebo karanténou doma pro mírné příznaky nebo ve zdravotnických zařízeních pro středně závažné až závažné příznaky. Testování v širokém měřítku navíc poskytuje informativnější epidemiologická data pro navrhování politik monitorování a kontroly nemocí. Bylo navrženo mnoho přístupů k detekci viru SARS-CoV-2 v nasofaryngeálních tekutinách, jako je multiplexní RT-PCR, CRISPR/Cas12 a CRISPR-Cas3, laterální průtokový imunotest, papírové bimolekulární senzory, testování SHERLOCK v jedné nádobě, DNA aptamer izotermická amplifikace zprostředkovaná smyčkou (LAMP) atd. Z těchto metod jsou pro diagnostiku SARS-CoV-2 nejběžnější testy založené na amplifikaci nukleové kyseliny.

Kromě toho, US CDC navrhuje protokol pro detekci SARS-CoV-2, založený na amplifikaci dvou oblastí nukleokapsidového genu, jmenovitě N1 a N2, a lidského vnitřního kontrolního genu RNázy P (RP). Kromě těchto strategií stále pokračují snahy vyvinout metody detekce SARS-CoV-2 s vysokou účinností a přesností, s menší reakční dobou a úsilím.

Přestože je testování považováno za zlatý standard pro detekci SARS CoV-2, v mnoha zemích zaostává kvůli různým faktorům, z nichž nejdůležitější jsou problémy s dodavatelským řetězcem s nedostatkem reagencií a adekvátních testovacích souprav. Proto mnoho pacientů (jak symptomatických, tak asymptomatických) zůstává netestováno, a proto potenciálně přispívají k šíření viru v komunitě.

Pokud Bangladéš dokáže vyrobit vlastní soupravy RT-PCR, které nejsou o nic méně kvalitní, pokud jde o citlivost, specifičnost atd., zmírnilo by to nedostatek soupravy RT-PCR, protože vyšetřovatelé jsou zcela závislí na dovážených testovacích soupravách a také ušetří zahraniční měnu. Kromě toho jsou testovací soupravy RT-PCR velmi citlivé na teplotu a potřebují zachovat chladící řetězec pro svou kvalitu, kterou lze zmírnit vyvinutím místní soupravy RT PCR. Navíc bylo vyvinuto mnoho variant SARS-CoV-2 kvůli mutaci, která vykazovala větší virulenci a vysokou přenosovou rychlost. Takže vývoj nového RT PCR kitu, který dokáže detekovat novější kmen, může být extrémně užitečný.

Zde je tedy cílem výzkumníků vyvinout třígenovou detekovatelnou robustní RT-PCR soupravu, která bude první v zemi a poskytne spolehlivé výsledky různých druhů variant viru SARS-CoV-2 pro snížení jeho přenosnosti a přijetí plánu preventivního řízení 2. Cíle studie:

1. Obecné cíle: Primární cíle jsou zaměřeny na vývoj multiplexní reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce v reálném čase (rRT-PCR) k detekci SARS-CoV-2.

2. Sekundární cíle: Pro nejlepší výkon RT-PCR by měla být optimalizována kombinace cílů genu E a N.

   3. Metodika: 3.1. Typ a účel studie: Toto je případová kontrolní a pozorovací studie, ve které jsou identifikovány a porovnány dvě existující skupiny zmrazených a čerstvých vzorků.

   3.2. Místo studia:

   • Ústav epidemiologie pro kontrolu a výzkum nemocí (IEDCR)
   • SLEČNA. Organizace klinického výzkumu sro 3.3. Stránky odběru vzorků:
   • Ústav epidemiologie pro kontrolu a výzkum nemocí (IEDCR) popř
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dháka, Bangladéš.

   3.4. Délka studia: • 3 měsíce (listopad 2021 až leden 2022) po získání etické prověrky od Bangladéšské rady pro lékařský výzkum.

   3.5. Studijní populace/výběr vzorku 3.5.1 CRO obdrží testovací vzorky od IEDCR. IEDCR a BCTL/CROL jako CRO mají memorandum o porozumění (MoU) pro různé společné výzkumné práce. NILMRC/BCTL/CROL tedy obdrží od IEDCR celkem 120 vzorků pro vyhodnocení účinnosti soupravy RT-PCR. Ze 120 vzorků bude 60 uloženo vzorků (30 známých pozitivních na COVID-19 a 30 negativních vzorků na COVID-19), které byly skladovány v laboratorních mrazicích boxech -80 °C v zařízeních IEDCR, a dalších 60 čerstvých vzorků (30 pozitivních na COVID-19 a 30 negativních vzorků na COVID-19), které jsou testovány v IEDCR. Vzorky s nesouhlasnými výsledky budou před testováním pomocí soupravy BRiCM RT PCR odmítnuty. To znamená, že může být zapotřebí více než 120 identifikovaných vzorků z IEDCR k analýze importovanými soupravami RT-PCR a extrakční soupravou v BCTL/CROL. Takto bude vybráno 120 vzorků pro hodnocení výkonu soupravy BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Aby se předešlo zaujatosti a střetu zájmů, sponzor a PI/spoluřešitelé budou zaslepeni, pokud jde o ID vzorku a pozitivní/negativní stav vzorků a klinické záznamy pacientů. Pozitivní/negativní stav skladovaných i čerstvých vzorků bude identifikován v IEDCR před odesláním do BCTL/CROL. To znamená, že pracovníci BCTL/CROL budou před analýzou rovněž zaslepeni, aby viděli vzorový identifikační doklad (ID) a pozitivní negativní/negativní stav. Nakonec vedoucí CRO zašle osvědčení o hodnocení výkonu PI nebo sponzorovi.

   3.5.3. Statistický základ velikosti vzorku:

   Vzorce:

   Studie se provádí na 120 účastnících (60 uložených známých pozitivních a negativních a 60 čerstvých známých pozitivních a negativních). Pro dosažení požadované absolutní přesnosti (n) při odhadování účinnosti RT-PCR je minimální velikost vzorku odhadnuta podle funkce diskrétní Bernoulliho pravděpodobnosti následovně:

   Alfa= 5% D= absolutní přesnost (%) s 95% spolehlivostí. Požadovaná absolutní přesnost n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Druhá odmocnina (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 8,009,84% 6,93 % 300 5,66 % 400 4,90 % 1 000 3,10 % 10 000 0,98 % 20 000 0,69 % 30 000 0,57 % 30000 0,57 % 100 000 0,3 % 3,6 Výběr vzorku s kritérii Pos 3. Kritéria pro výběr vzorků. 1 Kritéria 1 geny v IEDCR budou vybrány jako pozitivní na COVID-19. Vzorky s negativními výsledky RT-PCR bez amplifikace genů COVID-19 na IEDCR budou vybrány jako COVID-19.

   • Pohlaví: Vše
   • Věk: 5 až 70 let (dítě, dospělý, starší dospělý) 7.8.2. Kritéria vyloučení
   • Vzorky s nejednoznačnými/nejednoznačnými výsledky RT-PCR z hlediska sigmoidální křivky a hodnoty Ct budou vyloučeny.

   Souhlasy pacientů nejsou vyžadovány, protože CRO obdrží vzorky od IEDCR v souladu s MOU s IEDCR. Není tedy vyžadována registrace a souhlasy pacienta a CRF ze strany CRO.

   3.7 Postup sběru dat: Vzorky pozitivní na COVID-19 budou potvrzeny laboratorními nálezy pozitivních výsledků RT-PCR na virovou RNA.

   3.8 Analýza dat: Bude stanovena senzitivita, specificita, pozitivní prediktivní hodnota a negativní prediktivní hodnota soupravy BRiCM COVID-19 v reálném čase RT-PCR. Pro porovnání kategoriálních proměnných bude proveden test chí-kvadrát (oboustranný). Hodnota p ≤0,05 bude považována za úroveň významné asociace. Kromě senzitivity, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty a negativní prediktivní hodnoty bude také vypočítán Kappa koeficient, pozitivní věrohodnostní poměr a negativní věrohodnostní poměr.

   3.9 Databáze je zabezpečena proti neoprávněnému přístupu zavedenými bezpečnostními postupy; musí být udržovány příslušné záložní kopie databáze a souvisejících softwarových souborů. Databáze jsou zálohovány správcem databáze ve spojení s případnými aktualizacemi nebo změnami databáze.

   3.10 Zkoušející musí zpřístupnit údaje ze studie monitorujícímu a oprávněným zástupcům. Zkoušející musí v každých tříměsíčních intervalech poskytnout hlavnímu zkoušejícímu prozatímní zprávu o studii s údaji. Podle požadavků mohou být zprávy a údaje o studii poskytnuty Bangladéšské radě pro lékařský výzkum (BMRC) a Generálnímu ředitelství pro správu léčiv (DGDA). Vyšetřovatel musí zajistit spolehlivost a dostupnost zdrojových dokumentů.

   3.11 Monitorovací návštěvy budou provádět hlavní zkoušející, spoluřešitel a také zástupci podle pokynů pro správnou klinickou praxi (GCP).

   3.12 Aby byla zachována důvěrnost subjektu, pouze číslo místa, číslo subjektu a iniciály subjektu budou identifikovat všechny subjekty studie na formulářích Case Records (CRF) a další dokumentaci předložené zkoušejícímu. Další otázky týkající se důvěrnosti subjektu (pokud jsou relevantní) jsou uvedeny v dohodě o klinické studii.

   3.13 Všechny záznamy budou uchovávány v tajnosti pro PI, spoluřešitele, sponzora s výjimkou odpovědných osob IEDCR, které jsou odpovědné. Vzorky budou identifikovány jako kód/ID číslo a datum v IEDCR před odesláním do BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Pro tuto studii má zmíněný institut IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. provést klinickou studii, aby zjistila účinnost soupravy prostřednictvím jejich stávajících zdrojů. Kromě toho může CRO spravovat chemikálie, činidla a technologie, pokud jsou potřeba pro studii podle memoranda o porozumění mezi financujícími agenturami.

   5. Střet zájmů BRiCM je financující agenturou navrhované soupravy COVID-19 RT-PCR, je statutárním orgánem fungujícím pod administrativní kontrolou Ministerstva vědy a techniky. Je výzkumnou organizací a referenčním ústavem v oblasti chemických měření. Není to ani obchodní společnost, ani zisková organizace. Podle ústavní sankce je hlavní odpovědností BRiCM provádět výzkum vedoucí k takovým inovacím, které přidají hodnotu vládnímu úsilí o zajištění blahobytu lidí.