Eficácia de um kit Multiplex BangasureTM RT-PCR para a detecção de COVID-19 (COVID-19)

Introdução:

A pandemia do vírus corona COVID-19 é a crise de saúde global definidora de nosso tempo e o maior desafio enfrentado desde a Segunda Guerra Mundial. A pandemia é muito mais que uma crise de saúde; é também uma crise socioeconômica sem precedentes. Desde a sua identificação na região de Wuhan, na China, o vírus não apenas se espalhou por 213 países/territórios com 209 milhões de casos e 4,39 milhões globalmente, mas também pode tirar 400 milhões de pessoas de seus empregos, conforme estimativas da Organização Internacional do Trabalho.

Para conter a propagação da doença, estratégias multidisciplinares foram lançadas em diferentes regiões do mundo, incluindo a implementação de distanciamento social, manutenção da higiene pessoal, rastreamento de contatos e implementação de quarentena, restrições de viagens e bloqueios. Um método amplamente aceito é o teste para SARS-CoV-2, normalmente utilizando amostras de swab nasofaríngeo. Os pacientes testados positivos requerem tratamento clínico adequado por isolamento eficaz ou quarentena em casa para sintomas leves ou em unidades de saúde para sintomas moderados a graves. Além disso, testes em larga escala fornecem dados epidemiológicos mais informativos para a elaboração de políticas de monitoramento e controle de doenças. Muitas abordagens foram propostas para detectar o vírus SARS-CoV-2 em fluidos nasofaríngeos, como multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 e CRISPR-Cas3, imunoensaio de fluxo lateral, sensores bimoleculares baseados em papel, teste SHERLOCK em um pote, aptâmero de DNA , amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), etc. Entre esses métodos, os testes baseados em amplificação de ácidos nucleicos são os mais comuns para o diagnóstico de SARS-CoV-2.

Além disso, o US CDC sugere um protocolo para a detecção de SARS-CoV-2, baseado na amplificação de duas regiões do gene do nucleocapsídeo, a saber, N1 e N2, e um gene humano de controle interno RNase P (RP). Além dessas estratégias, esforços para desenvolver métodos de detecção de SARS-CoV-2 com alta eficiência e precisão, com menos tempo de reação e esforço, ainda estão em andamento.

No entanto, apesar de ser considerado o padrão-ouro para detecção de SARS CoV-2, o teste ficou para trás em muitos países devido a vários fatores, sendo o mais importante problemas na cadeia de suprimentos com falta de reagentes e kits de teste adequados. Portanto, muitos pacientes (sintomáticos e assintomáticos) permanecem não testados e, portanto, estão potencialmente contribuindo para a disseminação do vírus na comunidade.

Se Bangladesh puder produzir seus próprios kits de RT-PCR, que não são menos em termos de sensibilidade, especificidade, etc., isso atenuaria a escassez de kits de RT-PCR, pois os investigadores dependem totalmente de kits de teste importados e também economizam moeda estrangeira. Além disso, os kits de teste RT-PCR são muito sensíveis à temperatura e precisam manter a cadeia de frio para sua qualidade, o que pode ser atenuado pelo desenvolvimento de um kit RT PCR local. Além disso, muitas variantes do SARS-CoV-2 foram desenvolvidas devido à mutação, que mostrou mais virulência e alta taxa de transmissão. Portanto, o desenvolvimento de um novo kit RT PCR que pode detectar cepas mais recentes pode ser extremamente útil.

Portanto, aqui o objetivo do investigador é desenvolver o kit robusto de RT-PCR detectável de três genes que será o primeiro do país e fornecerá resultados confiáveis ​​de diferentes tipos de variantes do vírus SARS-CoV-2 para reduzir sua transmissibilidade e adotar o plano de gerenciamento preventivo 2. Objetivos do o estudo:

1. Objetivos gerais: Os objetivos principais visam desenvolver a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa multiplex em tempo real (rRT-PCR) para detectar o SARS-CoV-2.

2. Objetivos Secundários: Para o melhor desempenho do RT-PCR, a combinação dos alvos dos genes E e N deve ser otimizada.

   3. Metodologia: 3.1. Tipo e objetivo do estudo: Este é um estudo de caso-controle e observacional no qual dois grupos existentes de amostras congeladas e frescas são identificados e comparados.

   3.2. Local de estudo:

   • Instituto de Epidemiologia, Controle e Pesquisa de Doenças (IEDCR)
   • EM. Organização de Pesquisa Clínica Ltda 3.3. Locais de Coleta de Amostras:
   • Instituto de Controle e Pesquisa de Doenças de Epidemiologia (IEDCR) ou
   • Instituto Nacional de Medicina Laboratorial e Centro de Referência (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Duração do estudo: • 3 meses (novembro de 2021 a janeiro de 2022) após obter a autorização ética do Conselho de Pesquisa Médica de Bangladesh.

   3.5. População do estudo/seleção de amostra 3.5.1 CRO receberá amostras de teste do IEDCR. IEDCR e BCTL/CROL como CRO têm memorando de entendimento (MoU) para diferentes trabalhos de pesquisa colaborativa. Assim, o NILMRC/BCTL/CROL receberá um total de 120 amostras do IEDCR para avaliação da eficiência do kit RT-PCR. Das 120 amostras, 60 serão armazenadas (30 COVID-19 positivas conhecidas e 30 COVID-19 negativas) que foram mantidas a -80°C em freezers de laboratório nas instalações do IEDCR e outras 60 amostras frescas (30 COVID-19 positivas e 30 amostras negativas para COVID-19) que estão sendo testadas no IEDCR. Amostras com resultados discordantes serão rejeitadas antes do teste pelo kit BRiCM RT PCR. Ou seja, podem ser necessárias mais de 120 amostras identificadas do IEDCR para análise por kits RT-PCR importados e kit de extração no BCTL/CROL. Assim serão selecionadas 120 amostras para avaliação do desempenho do kit BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Para evitar tendenciosidade e conflitos de interesse, o patrocinador e os PI/coinvestigadores não terão acesso à ID da amostra e ao status positivo/negativo das amostras e registros clínicos dos pacientes. O status positivo/negativo das amostras armazenadas e frescas será identificado no IEDCR antes do envio para o BCTL/CROL. Ou seja, o pessoal do BCTL/CROL também será cegado para amostra de documento de identidade (ID) e status positivo negativo/negativo antes da análise. Por fim, o responsável pelo CRO enviará o certificado de avaliação de desempenho ao PI ou Patrocinador.

   3.5.3. Base estatística do tamanho da amostra:

   Fórmulas:

   O estudo é conduzido em 120 participantes (60 armazenados positivos e negativos conhecidos e 60 novos positivos e negativos conhecidos). Para alcançar a precisão absoluta desejada (n) na estimativa da eficiência de RT-PCR, o tamanho mínimo da amostra estimado seguindo a função de probabilidade discreta de Bernoulli da seguinte forma:

   Alfa= 5% D= Precisão absoluta (%) com 95% de confiança. Precisão absoluta desejada n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Raiz quadrada (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 8,94% 100 9,80% 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% 3,6 Critérios de seleção de amostras 3.6.1 Critérios de inclusão: Amostras com resultados positivos de RT-PCR com valor de Ct≤395 para COVID genes no IEDCR serão selecionados como positivos para COVID-19. Amostras com resultados negativos de RT-PCR sem amplificação para os genes COVID-19 no IEDCR serão selecionadas como COVID-19.

   • Gênero: Todos
   • Idade: 5 a 70 anos (Criança, Adulto, Idoso) 7.8.2. Critério de exclusão
   • As amostras com resultados de RT-PCR duvidosos/ambíguos em termos de curva sigmoidal e valor de Ct serão excluídas.

   O consentimento dos pacientes não é necessário porque o CRO receberá as amostras do IEDCR de acordo com o MOU com o IEDCR. Portanto, não há exigência de inscrição e consentimento do paciente e CRF do lado do CRO.

   3.7 Procedimento de Coleta de Dados: As amostras positivas para COVID-19 serão confirmadas por achados laboratoriais de resultados positivos de RT-PCR para o RNA viral.

   3.8 Análise de Dados: Serão determinados a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do kit BRiCM COVID-19 RT-PCR em tempo real. O teste qui-quadrado (bilateral) será realizado para comparação de variáveis ​​categóricas. Um valor de p ≤0,05 será considerado como o nível de associação significativa. Juntamente com a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, também serão calculados o coeficiente Kappa, a razão de verossimilhança positiva e a razão de verossimilhança negativa.

   3.9 A base de dados é protegida contra acesso não autorizado por procedimentos de segurança estabelecidos; cópias de backup apropriadas do banco de dados e arquivos de software relacionados devem ser mantidas. O backup dos bancos de dados é feito pelo administrador do banco de dados em conjunto com quaisquer atualizações ou alterações no banco de dados.

   3.10 O Investigador deve tornar os dados do estudo acessíveis ao monitor e aos representantes autorizados. O investigador deve fornecer um relatório de estudo provisório com dados a cada três meses ao investigador principal. De acordo com os requisitos, o relatório e os dados do estudo podem ser fornecidos ao Conselho de Pesquisa Médica de Bangladesh (BMRC) e à Diretoria Geral de Administração de Medicamentos (DGDA). O Investigador deve garantir a confiabilidade e disponibilidade dos documentos de origem.

   3.11 As visitas de monitoramento serão conduzidas pelo investigador principal, co-investigador, bem como pelos representantes de acordo com as Diretrizes para Boas Práticas Clínicas (GCP).

   3.12 A fim de manter a confidencialidade do sujeito, apenas o número do centro, o número do sujeito e as iniciais do sujeito identificarão todos os sujeitos do estudo nos Formulários de Registro de Caso (CRF) e outra documentação enviada ao investigador. Questões adicionais de confidencialidade do assunto (se aplicável) são abordadas no Acordo de Estudo Clínico.

   3.13 Todos os registros serão mantidos em segredo para o PI, co-investigadores, patrocinador, exceto os responsáveis ​​do IEDCR que estão no comando. As amostras serão identificadas como código/número de ID e data no IEDCR antes de serem enviadas para BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Para este estudo, o instituto mencionado IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. conduzir o ensaio clínico para descobrir a eficácia do kit por meio de seu recurso existente. Além disso, o CRO pode gerenciar o produto químico, o reagente e a tecnologia, se necessário, para o estudo de acordo com o MoU entre as agências de financiamento.

   5. Conflito de interesses A BRiCM é a agência financiadora do kit COVID-19 RT-PCR proposto, é um órgão estatutário que funciona sob o controle administrativo do Ministério da Ciência e Tecnologia. É uma organização de pesquisa e um instituto de referência na área de medições químicas. Não é uma empresa comercial nem uma organização com fins lucrativos. De acordo com a sanção constitucional, a principal responsabilidade do BRiCM é realizar pesquisas que levem a inovações que agreguem valor ao esforço do governo para garantir o bem-estar do povo.