Eficacia de un kit Multiplex BangasureTM RT-PCR para la detección de COVID-19 (COVID-19)

Introducción:

La pandemia del coronavirus COVID-19 es la crisis de salud global que define nuestro tiempo y el mayor desafío al que se ha enfrentado desde la Segunda Guerra Mundial. La pandemia es mucho más que una crisis sanitaria; también es una crisis socioeconómica sin precedentes. Desde su identificación en la región de Wuhan, China, no solo el virus se ha extendido por 213 países/territorios con 209 millones de casos y 4,39 millones a nivel mundial, sino que también podría dejar sin trabajo a 400 millones de personas, según estimaciones de la Organización Internacional del Trabajo.

Para contener la propagación de la enfermedad, se han lanzado estrategias multidisciplinarias en diferentes regiones del mundo, incluida la implementación del distanciamiento social, el mantenimiento de la higiene personal, el rastreo de contactos y la implementación de cuarentenas, restricciones de viaje y bloqueos. Un método ampliamente aceptado es la prueba de SARS-CoV-2, generalmente utilizando muestras de hisopos nasofaríngeos. Los pacientes que dieron positivo en la prueba requieren un manejo clínico adecuado mediante aislamiento efectivo o cuarentena en el hogar para síntomas leves o dentro de los centros de atención médica para síntomas moderados a graves. Además, las pruebas a gran escala proporcionan datos epidemiológicos más informativos para la redacción de políticas sobre seguimiento y control de enfermedades. Se han propuesto muchos enfoques para detectar el virus SARS-CoV-2 en fluidos nasofaríngeos, como RT-PCR multiplex, CRISPR/Cas12 y CRISPR-Cas3, inmunoensayo de flujo lateral, sensores bimoleculares basados ​​en papel, pruebas SHERLOCK en un recipiente, aptámero de ADN , amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), etc. Entre estos métodos, las pruebas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos son las más comunes para el diagnóstico del SARS-CoV-2.

Además, los CDC de EE. UU. sugieren un protocolo para la detección del SARS-CoV-2, basado en la amplificación de dos regiones del gen de la nucleocápside, a saber, N1 y N2, y un gen de control interno humano RNasa P (RP). Además de estas estrategias, aún continúan los esfuerzos para desarrollar métodos de detección de SARS-CoV-2 con alta eficiencia y precisión, con menos tiempo de reacción y esfuerzo.

Sin embargo, a pesar de ser considerado como el estándar de oro para la detección del SARS CoV-2, las pruebas se han quedado rezagadas en muchos países debido a varios factores, siendo el más importante los problemas de la cadena de suministro con la falta de reactivos y kits de prueba adecuados. Por lo tanto, muchos pacientes (tanto sintomáticos como asintomáticos) siguen sin hacerse la prueba y, por lo tanto, contribuyen potencialmente a la propagación del virus en la comunidad.

Si Bangladesh puede producir sus propios kits de RT-PCR que no sean de menor calidad en términos de sensibilidad, especificidad, etc., eso mitigaría la escasez de kits de RT-PCR, ya que los investigadores dependen totalmente de los kits de prueba importados y también ahorraría divisas. Además, los kits de prueba de RT-PCR son muy sensibles a la temperatura y necesitan mantener la cadena de frío para su calidad, lo que puede mitigarse desarrollando un kit de RT PCR local. Además, se han desarrollado muchas variantes del SARS-CoV-2 debido a la mutación, que ha mostrado más virulencia y una alta tasa de transmisión. Por lo tanto, el desarrollo de un nuevo kit de RT PCR que pueda detectar cepas más nuevas puede ser extremadamente útil.

Por lo tanto, aquí el objetivo del investigador es desarrollar el kit de RT-PCR robusto detectable de tres genes que será el primero en el país y dará un resultado confiable de diferentes tipos de variantes del virus SARS-CoV-2 para reducir su transmisibilidad y tomar el plan de manejo preventivo 2. Objetivos de el estudio:

1. Objetivos generales: Los objetivos principales tienen como objetivo desarrollar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa multiplex en tiempo real (rRT-PCR) para detectar el SARS-CoV-2.

2. Objetivos secundarios: Para obtener el mejor rendimiento de la RT-PCR, se debe optimizar la combinación de objetivos de genes E y N.

   3. Metodología: 3.1. Tipo de estudio y propósito: Este es un estudio observacional y de control de casos en el que se identifican y comparan dos grupos existentes de muestras frescas y congeladas.

   3.2. Lugar de estudio:

   • Instituto de Epidemiología, Control e Investigación de Enfermedades (IEDCR)
   • EM. Organización de Investigación Clínica Ltda. 3.3. Sitio(s) de recolección de muestras:
   • Instituto de Epidemiología, Control e Investigación de Enfermedades (IEDCR) o
   • Instituto Nacional de Medicina de Laboratorio y Centro de Referencia (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Duración del estudio: • 3 meses (noviembre de 2021 a enero de 2022) después de obtener la autorización ética del Consejo de Investigación Médica de Bangladesh.

   3.5. Selección de muestra/población de estudio 3.5.1 CRO recibirá muestras de prueba de IEDCR. IEDCR y BCTL/CROL como CRO tienen un memorando de entendimiento (MoU) para diferentes trabajos de investigación en colaboración. Por lo tanto, NILMRC/BCTL/CROL recibirá un total de 120 muestras de IEDCR para la evaluación de la eficiencia del kit RT-PCR. De las 120 muestras, 60 serán muestras almacenadas (30 muestras positivas conocidas de COVID-19 y 30 negativas de COVID-19) que se han mantenido a -80 °C en congeladores de laboratorio en las instalaciones de IEDCR y otras 60 muestras frescas (30 muestras positivas de COVID-19). y 30 muestras negativas de COVID-19) que están siendo analizadas en IEDCR. Las muestras con resultados discordantes se rechazarán antes de analizarlas con el kit BRiCM RT PCR. Es decir, es posible que se necesiten más de 120 muestras identificadas de IEDCR para analizarlas mediante kits de RT-PCR y kits de extracción importados en BCTL/CROL. Es así como se seleccionarán 120 muestras para la evaluación del desempeño del kit BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Para evitar sesgos y conflictos de intereses, el patrocinador y el IP/co-investigadores no conocerán la identificación de la muestra y el estado positivo/negativo de las muestras y los registros clínicos de los pacientes. El estado positivo/negativo de las muestras almacenadas y frescas se identificará en IEDCR antes de enviarlas a BCTL/CROL. Es decir, el personal de BCTL/CROL también estará cegado al documento de identidad (ID) de la muestra y al estado positivo negativo/negativo antes del análisis. Finalmente, el jefe de CRO enviará el certificado de evaluación de desempeño al PI o patrocinador.

   3.5.3. Base estadística del tamaño de la muestra:

   Fórmulas:

   El estudio se lleva a cabo en 120 participantes (60 positivos y negativos conocidos almacenados y 60 positivos y negativos nuevos conocidos). Para lograr la precisión absoluta deseada (n) en la estimación de la eficiencia de RT-PCR, el tamaño mínimo de la muestra se estimó siguiendo la función de probabilidad discreta de Bernoulli de la siguiente manera:

   Alfa= 5% D= Precisión absoluta (%) con 95% de confianza. Precisión absoluta deseada n D Alfa=5% Z=1.96 10 30.99% n D= (1.96)/(2* Raíz cuadrada (SQRT) (n)) 20 21.91% 100 9.80% 30 17.89% 120 8.94% 100 9.80% 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% 3.6 Criterios de selección de muestras 3.6.1 Criterios de inclusión: Muestras con resultados positivos de RT-PCR con valor de Ct≤195 para el COVID-195 los genes en IEDCR serán seleccionados como positivos para COVID-19. Las muestras con resultados negativos de RT-PCR sin amplificación de los genes COVID-19 en IEDCR se seleccionarán como COVID-19.

   • Género: Todos
   • Edad: 5 a 70 años (Niño, Adulto, Adulto Mayor) 7.8.2. Criterio de exclusión
   • Se excluirán las muestras con resultados de RT-PCR equívocos/ambiguos en términos de curva sigmoidal y valor Ct.

   No se requiere el consentimiento de los pacientes porque el CRO recibirá las muestras de IEDCR según el MOU con IEDCR. Por lo tanto, no hay ningún requisito de inscripción y consentimiento del paciente y CRF por parte de la CRO.

   3.7 Procedimiento de recopilación de datos: las muestras positivas de COVID-19 se confirmarán mediante hallazgos de laboratorio de resultados positivos de RT-PCR para el ARN viral.

   3.8 Análisis de datos: se determinará la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo del kit BRiCM COVID-19 RT-PCR en tiempo real. Se realizará la prueba de chi-cuadrado (bilateral) para comparar variables categóricas. Se considerará como nivel de asociación significativa un valor de p ≤0,05. Además de la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo, también se calcularán el coeficiente Kappa, la razón de verosimilitud positiva y la razón de verosimilitud negativa.

   3.9 La base de datos está protegida contra el acceso no autorizado mediante procedimientos de seguridad establecidos; se mantendrán copias de seguridad apropiadas de la base de datos y los archivos de software relacionados. El administrador de la base de datos realiza una copia de seguridad de las bases de datos junto con cualquier actualización o cambio en la base de datos.

   3.10 El investigador debe poner los datos del estudio a disposición del monitor y los representantes autorizados. El investigador debe proporcionar un informe de estudio provisional con datos cada tres meses al investigador principal. Según el informe y los datos del estudio de requisitos, se pueden proporcionar al Consejo de Investigación Médica de Bangladesh (BMRC) y a la Dirección General de Administración de Medicamentos (DGDA). El Investigador debe garantizar la confiabilidad y disponibilidad de los documentos fuente.

   3.11 Las visitas de seguimiento serán realizadas por el investigador principal, el coinvestigador y los representantes de acuerdo con las Directrices de Buenas Prácticas Clínicas (BPC).

   3.12 Para mantener la confidencialidad de los sujetos, solo un número de sitio, un número de sujeto y las iniciales de los sujetos identificarán a todos los sujetos del estudio en los formularios de registros de casos (CRF) y otra documentación enviada al investigador. Las cuestiones adicionales de confidencialidad del sujeto (si corresponde) están cubiertas en el Acuerdo de estudio clínico.

   3.13 Todos los registros se mantendrán en secreto para el PI, los co-investigadores, el patrocinador, excepto las personas responsables de IEDCR que estén a cargo. Las muestras se identificarán como código/número de ID y fecha en IEDCR antes de enviarlas a BCTL/Contact Research Organisation Limited (CROL) 4. Para este estudio, el instituto mencionado IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. tiene la capacidad de realizar el ensayo clínico para averiguar la eficacia del kit a través de su recurso existente. Además, CRO puede administrar el producto químico, el reactivo y la tecnología, si es necesario, para el estudio según el MoU entre las agencias de financiación.

   5. Conflicto de intereses BRiCM es la agencia de financiación del kit COVID-19 RT-PCR propuesto, es un organismo estatutario que funciona bajo el control administrativo del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Es una organización de investigación y un instituto de referencia en el área de las mediciones químicas. No es una empresa comercial ni una organización lucrativa. De acuerdo con la sanción constitucional, la responsabilidad principal del BRiCM es llevar a cabo investigaciones que conduzcan a tal innovación que agregue valor al esfuerzo del gobierno para garantizar el bienestar de las personas.