Skuteczność zestawu Multiplex Bangasure RT-PCR do wykrywania COVID-19 (COVID-19)

Wstęp:

Pandemia wirusa koronowego COVID-19 jest definiującym globalny kryzys zdrowotny naszych czasów i największym wyzwaniem, przed którym stoi od czasów drugiej wojny światowej. Pandemia to znacznie więcej niż kryzys zdrowotny; to także bezprecedensowy kryzys społeczno-gospodarczy. Od czasu jego identyfikacji w regionie Wuhan w Chinach wirus nie tylko rozprzestrzenił się w 213 krajach/terytoriach z 209 milionami przypadków i 4,39 milionami na całym świecie, ale także może pozbawić pracy 400 milionów ludzi, jak szacuje Międzynarodowa Organizacja Pracy.

Aby powstrzymać rozprzestrzenianie się choroby, w różnych regionach świata wdrożono multidyscyplinarne strategie, w tym wdrażanie dystansu społecznego, utrzymywanie higieny osobistej, śledzenie kontaktów oraz wdrażanie kwarantanny, ograniczeń w podróżowaniu i blokad. Powszechnie akceptowaną metodą jest badanie na obecność SARS-CoV-2, zwykle z wykorzystaniem wymazów z jamy nosowo-gardłowej. Pacjenci z pozytywnym wynikiem testu wymagają odpowiedniego postępowania klinicznego poprzez skuteczną izolację lub kwarantannę w domu w przypadku łagodnych objawów lub w placówce opieki zdrowotnej w przypadku objawów o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego. Ponadto testy na szeroką skalę dostarczają bardziej pouczających danych epidemiologicznych do opracowywania polityk dotyczących monitorowania i kontroli chorób. Zaproponowano wiele podejść do wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w płynach nosowo-gardłowych, takich jak multipleks RT-PCR, CRISPR/Cas12 i CRISPR-Cas3, test immunologiczny przepływu bocznego, czujniki bimolekularne na papierze, testy SHERLOCK w jednym naczyniu, aptamer DNA , amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) itp. Spośród tych metod testy oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych są najczęściej stosowane w diagnostyce SARS-CoV-2.

Ponadto amerykańskie CDC proponuje protokół wykrywania SARS-CoV-2, oparty na amplifikacji dwóch regionów genu nukleokapsydu, czyli N1 i N2, oraz ludzkiego genu kontroli wewnętrznej RNazy P (RP). Oprócz tych strategii nadal trwają prace nad opracowaniem metod wykrywania SARS-CoV-2 o wysokiej skuteczności i dokładności, przy mniejszym czasie reakcji i mniejszym wysiłku.

Jednak pomimo tego, że uważa się je za złoty standard wykrywania SARS CoV-2, w wielu krajach testy pozostają w tyle z powodu różnych czynników, z których najważniejszymi są problemy z łańcuchem dostaw z brakiem odczynników i odpowiednich zestawów testowych. Dlatego wielu pacjentów (zarówno z objawami, jak i bezobjawowymi) pozostaje nieprzebadanych, a zatem potencjalnie przyczynia się do rozprzestrzeniania się wirusa w społeczności.

Gdyby Bangladesz mógł wyprodukować własne zestawy RT-PCR, których jakość nie byłaby gorsza pod względem czułości, swoistości itp., zmniejszyłoby to niedobór zestawów RT-PCR, ponieważ badacze są całkowicie zależni od importowanych zestawów testowych, a także oszczędzają obcą walutę. Ponadto zestawy testowe RT-PCR są bardzo wrażliwe na temperaturę i wymagają utrzymania łańcucha chłodniczego ze względu na swoją jakość, co można złagodzić, opracowując lokalny zestaw RT PCR. Ponadto wiele wariantów SARS-CoV-2 zostało opracowanych w wyniku mutacji, która wykazała większą zjadliwość i wysoką szybkość transmisji. Tak więc opracowanie nowego zestawu RT PCR, który może wykryć nowszy szczep, może być niezwykle pomocne.

Tak więc celem badacza jest opracowanie solidnego zestawu RT-PCR z trzema wykrywalnymi genami, który będzie pierwszym w kraju i da wiarygodne wyniki dla różnych rodzajów wariantów wirusa SARS-CoV-2 w celu zmniejszenia jego przenoszenia i podjęcia planu zarządzania zapobiegawczego 2. Cele badania:

1. Cele ogólne: Główne cele mają na celu opracowanie multipleksowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (rRT-PCR) w celu wykrycia SARS-CoV-2.

2. Cele drugorzędne: Aby uzyskać najlepszą wydajność RT-PCR, należy zoptymalizować kombinację docelowych genów E i N.

   3. Metodologia: 3.1. Rodzaj i cel badania: Jest to badanie kliniczno-kontrolne i obserwacyjne, w którym identyfikuje się i porównuje dwie istniejące grupy zamrożonych i świeżych próbek.

   3.2. Miejsce nauki:

   • Instytut Epidemiologii Kontroli i Badań Chorób (IEDCR)
   • SM. Organizacja Badań Klinicznych Ltd 3.3. Miejsca pobierania próbek:
   • Instytut Epidemiologii Kontroli i Badań Chorób (IEDCR) lub
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dhaka, Bangladesz.

   3.4. Czas trwania studiów: • 3 miesiące (listopad 2021 do stycznia 2022) po uzyskaniu zezwolenia etycznego od Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Badana populacja/dobór próby 3.5.1 CRO otrzyma próbki do badań z IEDCR. IEDCR i BCTL/CROL jako CRO mają protokół ustaleń (MoU) dotyczący różnych wspólnych prac badawczych. Tak więc NILMRC/BCTL/CROL otrzyma łącznie 120 próbek z IEDCR do oceny wydajności zestawu RT-PCR. Spośród 120 próbek 60 będzie przechowywanych (30 próbek z pozytywnym wynikiem na obecność COVID-19 i 30 z wynikiem ujemnym na obecność COVID-19), które były przechowywane w zamrażarkach laboratoryjnych w temperaturze -80°C w obiektach IEDCR, a kolejne 60 świeżych próbek (30 z pozytywnym wynikiem na obecność COVID-19 i 30 próbek z wynikiem ujemnym w kierunku COVID-19), które są testowane w IEDCR. Próbki z niezgodnymi wynikami zostaną odrzucone przed badaniem za pomocą zestawu BRiCM RT PCR. Oznacza to, że do analizy za pomocą importowanych zestawów RT-PCR i zestawu do ekstrakcji w BCTL/CROL może być potrzebnych ponad 120 zidentyfikowanych próbek z IEDCR. W ten sposób zostanie wybranych 120 próbek do oceny działania zestawu BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Aby uniknąć stronniczości i konfliktów interesów, sponsor i PI/współbadacze nie będą znali identyfikatora próbki oraz pozytywnego/negatywnego statusu próbek i dokumentacji klinicznej pacjentów. Pozytywny/negatywny status zarówno przechowywanych, jak i świeżych próbek zostanie zidentyfikowany w IEDCR przed wysłaniem do BCTL/CROL. Oznacza to, że personel BCTL/CROL będzie również zaślepiony na przykładowy dokument tożsamości (ID) i pozytywny negatywny/negatywny status przed analizą. Na koniec szef CRO prześle certyfikat oceny wyników do PI lub Sponsora.

   3.5.3. Statystyczna podstawa wielkości próby:

   Formuły:

   Badanie jest prowadzone na 120 uczestnikach (60 zapisanych znanych pozytywnych i negatywnych oraz 60 świeżych znanych pozytywnych i negatywnych). Aby osiągnąć żądaną bezwzględną dokładność (n) w szacowaniu wydajności RT-PCR, minimalna wielkość próbki oszacowana zgodnie z dyskretną funkcją prawdopodobieństwa Bernoulliego w następujący sposób:

   Alfa= 5% D= absolutna Dokładność (%) z 95% pewnością. Żądana Dokładność bezwzględna n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* Pierwiastek kwadratowy (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 8,94% 100 9,80% 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% 3.6 Kryteria wyboru próbki 3.6.1 Kryteria włączenia: Próbki z wynikiem pozytywnym Wyniki RT-PCR z wartością Ct ≤-19 dla COVID35 geny w IEDCR zostaną wybrane jako pozytywne dla COVID-19. Próbki z negatywnymi wynikami RT-PCR bez amplifikacji genów COVID-19 w IEDCR zostaną wybrane jako COVID-19.

   • Płeć: Wszyscy
   • Wiek: od 5 do 70 lat (Dziecko, Dorosły, Starszy Dorosły) 7.8.2. Kryteria wyłączenia
   • Próbki z niejednoznacznymi/niejednoznacznymi wynikami RT-PCR pod względem krzywej sigmoidalnej i wartości Ct zostaną wykluczone.

   Zgody pacjentów nie są wymagane, ponieważ CRO otrzyma próbki z IEDCR zgodnie z MOU z IEDCR. Nie ma więc wymogu rejestracji i zgód pacjenta oraz CRF ze strony CRO.

   3.7 Procedura zbierania danych: Próbki dodatnie w kierunku COVID-19 zostaną potwierdzone wynikami laboratoryjnymi dodatnich wyników RT-PCR dla wirusowego RNA.

   3.8 Analiza danych: Określona zostanie czułość, swoistość, dodatnia i ujemna wartość predykcyjna zestawu BRiCM COVID-19 real time RT-PCR. Test chi-kwadrat (dwustronny) zostanie przeprowadzony w celu porównania zmiennych kategorialnych. Wartość p ≤0,05 zostanie uznana za poziom istotnego związku. Oprócz czułości, specyficzności, dodatniej wartości predykcyjnej i ujemnej wartości predykcyjnej, zostanie również obliczony współczynnik Kappa, dodatni iloraz wiarygodności i ujemny iloraz wiarygodności.

   3.9 Baza danych jest zabezpieczona przed nieautoryzowanym dostępem przez ustanowione procedury bezpieczeństwa; należy przechowywać odpowiednie kopie zapasowe bazy danych i związanych z nią plików oprogramowania. Kopie zapasowe baz danych są tworzone przez administratora bazy danych w związku z wszelkimi aktualizacjami lub zmianami w bazie danych.

   3.10 Badacz musi udostępnić dane z badania monitorującemu i upoważnionym przedstawicielom. Badacz musi co trzy miesiące dostarczać głównemu badaczowi tymczasowy raport z badania zawierający dane. Zgodnie z wymaganiami raport z badania i dane mogą zostać przekazane Radzie ds. Badań Medycznych Bangladeszu (BMRC) i Dyrekcji Generalnej ds. Administracji Lekami (DGDA). Badacz musi zapewnić rzetelność i dostępność dokumentów źródłowych.

   3.11 Wizyty monitorujące będą prowadzone przez głównego badacza, współbadacza oraz przedstawicieli zgodnie z Wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej (GCP).

   3.12 Aby zachować poufność uczestników, tylko numer ośrodka, numer podmiotu i inicjały uczestników będą identyfikować wszystkich uczestników badania w formularzach dokumentacji przypadków (CRF) i innej dokumentacji przedłożonej badaczowi. Dodatkowe kwestie dotyczące poufności przedmiotu (jeśli dotyczy) są ujęte w Umowie dotyczącej badania klinicznego.

   3.13 Wszystkie zapisy będą utrzymywane w tajemnicy dla PI, współbadaczy, sponsora, z wyjątkiem odpowiedzialnych osób odpowiedzialnych za IEDCR. Próbki zostaną oznaczone kodem/numerem identyfikacyjnym i datą w IEDCR przed wysłaniem do BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Na potrzeby tego badania wspomniany instytut IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. ma możliwość przeprowadzić badanie kliniczne, aby sprawdzić skuteczność zestawu za pośrednictwem swoich istniejących zasobów. Poza tym CRO może zarządzać chemikaliami, odczynnikami i technologią, jeśli są potrzebne do badania, zgodnie z protokołem ustaleń między agencjami finansującymi.

   5. Konflikt interesów BRiCM jest agencją finansującą proponowany zestaw COVID-19 RT-PCR, jest organem statutowym funkcjonującym pod kontrolą administracyjną Ministerstwa Nauki i Technologii. Jest organizacją badawczą i instytutem referencyjnym w zakresie pomiarów chemicznych. Nie jest przedsiębiorstwem komercyjnym ani organizacją nastawioną na zysk. Zgodnie z sankcją konstytucyjną głównym obowiązkiem BRiCM jest prowadzenie badań prowadzących do takich innowacji, które wniosą wartość dodaną do wysiłków rządu na rzecz zapewnienia dobrobytu ludności.