Efficacité d'un kit Multiplex BangasureTM RT-PCR pour la détection du COVID-19 (COVID-19)

Introduction:

La pandémie du virus corona COVID-19 est la crise sanitaire mondiale déterminante de notre époque et le plus grand défi auquel nous sommes confrontés depuis la Seconde Guerre mondiale. La pandémie est bien plus qu'une crise sanitaire; c'est aussi une crise socio-économique sans précédent. Depuis son identification dans la région de Wuhan, en Chine, non seulement le virus s'est propagé dans 213 pays/territoires avec 209 millions de cas et 4,39 millions dans le monde, mais il pourrait également mettre 400 millions de personnes au chômage, selon les estimations de l'Organisation internationale du travail.

Pour contenir la propagation de la maladie, des stratégies multidisciplinaires ont été lancées dans différentes régions du monde, notamment la mise en œuvre de la distanciation sociale, le maintien de l'hygiène personnelle, la recherche des contacts et la mise en œuvre de la quarantaine, des restrictions de voyage et des confinements. Une méthode largement acceptée consiste à tester le SRAS-CoV-2, en utilisant généralement des échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé. Les patients testés positifs nécessitent une prise en charge clinique appropriée par un isolement efficace ou une mise en quarantaine à domicile pour les symptômes légers ou dans les établissements de santé pour les symptômes modérés à sévères. En outre, les tests à grande échelle fournissent des données épidémiologiques plus informatives pour l'élaboration de politiques sur la surveillance et le contrôle des maladies. De nombreuses approches ont été proposées pour détecter le virus SARS-CoV-2 dans les fluides nasopharyngés tels que la RT-PCR multiplex, CRISPR/Cas12 et CRISPR-Cas3, l'immunodosage à flux latéral, les capteurs bimoléculaires à base de papier, le test SHERLOCK dans un pot, l'aptamère d'ADN , amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), etc. Parmi ces méthodes, les tests basés sur l'amplification des acides nucléiques sont les plus courants pour le diagnostic du SRAS-CoV-2.

De plus, le CDC américain propose un protocole de détection du SRAS-CoV-2, basé sur l'amplification de deux régions du gène de la nucléocapside, à savoir N1 et N2, et d'un gène de contrôle interne humain RNase P (RP). En plus de ces stratégies, les efforts pour développer des méthodes de détection du SRAS-CoV-2 avec une efficacité et une précision élevées, avec moins de temps de réaction et d'efforts, sont toujours en cours.

Cependant, bien qu'ils soient considérés comme l'étalon-or pour la détection du SRAS CoV-2, les tests ont pris du retard dans de nombreux pays en raison de divers facteurs, les plus importants étant les problèmes de chaîne d'approvisionnement avec le manque de réactifs et de kits de test adéquats. Par conséquent, de nombreux patients (à la fois symptomatiques et asymptomatiques) ne sont pas testés et contribuent donc potentiellement à la propagation communautaire du virus.

Si le Bangladesh peut produire ses propres kits de RT-PCR qui ne sont pas moins de qualité en termes de sensibilité, de spécificité, etc., cela atténuerait la pénurie de kits de RT-PCR car les enquêteurs dépendent totalement des kits de test importés et économisent également des devises étrangères. De plus, les kits de test RT-PCR sont très sensibles à la température et doivent maintenir la chaîne du froid pour sa qualité, ce qui peut être atténué en développant un kit RT PCR local. De plus, de nombreuses variantes du SRAS-CoV-2 ont été développées en raison d'une mutation, qui a montré plus de virulence et un taux de transmission élevé. Ainsi, le développement d'un nouveau kit RT PCR capable de détecter une nouvelle souche peut être extrêmement utile.

Donc, ici, l'objectif de l'investigateur est de développer le kit RT-PCR robuste détectable à trois gènes qui sera le premier pays et donnera un résultat fiable de différents types de variantes du virus SARS-CoV-2 pour réduire sa transmissibilité et prendre le plan de gestion préventive 2. Objectifs de l'étude:

1. Objectifs généraux : Les principaux objectifs visent à développer une réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse en temps réel multiplex (rRT-PCR) pour détecter le SRAS-CoV-2.

2. Objectifs secondaires : Pour obtenir les meilleures performances de RT-PCR, la combinaison des gènes cibles E et N doit être optimisée.

   3. Méthodologie : 3.1. Type et objectif de l'étude : Il s'agit d'une étude cas-témoins et observationnelle dans laquelle deux groupes existants d'échantillons congelés et frais sont identifiés et comparés.

   3.2. Lieu d'étude:

   • Institut Epidémiologie Contrôle et Recherche des Maladies (IEDCR)
   • SP. Organisation de Recherche Clinique Ltd 3.3. Site(s) de prélèvement d'échantillons :
   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) ou
   • Institut national de médecine de laboratoire et centre de référence (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Durée de l'étude : • 3 mois (novembre 2021 à janvier 2022) après avoir obtenu l'autorisation éthique du Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Population de l'étude/sélection de l'échantillon 3.5.1 Le CRO recevra des échantillons de test de l'IEDCR. IEDCR et BCTL/CROL en tant que CRO ont un protocole d'accord (MoU) pour différents travaux de recherche en collaboration. Ainsi, NILMRC/BCTL/CROL recevra un total de 120 échantillons de l'IEDCR pour l'évaluation de l'efficacité du kit RT-PCR. Sur les 120 échantillons, 60 seront des échantillons stockés (30 échantillons COVID-19 positifs connus et 30 échantillons négatifs COVID-19) qui ont été conservés dans des congélateurs de laboratoire à -80°C dans les installations de l'IEDCR et 60 autres échantillons frais (30 échantillons positifs COVID-19 et 30 échantillons négatifs au COVID-19) qui sont testés à l'IEDCR. Les échantillons avec des résultats discordants seront rejetés avant d'être testés par le kit BRiCM RT PCR. Autrement dit, plus de 120 échantillons identifiés de l'IEDCR pourraient être nécessaires pour être analysés par des kits de RT-PCR importés et un kit d'extraction au BCTL/CROL. C'est ainsi que 120 échantillons seront sélectionnés pour l'évaluation des performances du kit BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Pour éviter les préjugés et les conflits d'intérêts, le promoteur et les PI/co-investigateurs ne seront pas informés de l'ID de l'échantillon et du statut positif/négatif des échantillons et des dossiers cliniques des patients. Le statut positif/négatif des échantillons stockés et frais sera identifié à l'IEDCR avant d'être envoyé à BCTL/CROL. C'est-à-dire que le personnel de BCTL/CROL sera également aveuglé par l'échantillon de pièce d'identité (ID) et le statut positif négatif/négatif avant l'analyse. Enfin, le responsable du CRO enverra le certificat d'évaluation des performances au PI ou au sponsor.

   3.5.3. Base statistique de la taille de l'échantillon :

   Formule :

   L'étude est menée sur 120 participants (60 positifs et négatifs connus stockés et 60 positifs et négatifs connus frais). Pour obtenir la précision absolue souhaitée (n) dans l'estimation de l'efficacité de la RT-PCR, la taille d'échantillon minimale estimée suit la fonction de probabilité discrète de Bernoulli comme suit :

   Alfa = 5 % D = Précision absolue (%) avec 95 % de confiance. Précision absolue souhaitée n D Alfa=5 % Z=1,96 10 30,99 % n D= (1,96)/(2* Racine carrée (SQRT) (n)) 20 21,91 % 100 9,80 % 30 17,89 % 120 8,94 % 100 9,80 % 200 6,93 % 300 5,66 % 400 4,90 % 1 000 3,10 % 10 000 0,98 % 20 000 0,69 % 30 000 0,57 % 100 000 0,3 % les gènes à l'IEDCR seront sélectionnés comme COVID-19 positifs. Les échantillons avec des résultats de RT-PCR négatifs sans amplification pour les gènes COVID-19 à l'IEDCR seront sélectionnés comme COVID-19.

   • Genre : Tous
   • Âge : 5 à 70 ans (Enfant, Adulte, Aîné) 7.8.2. Critère d'exclusion
   • Les échantillons avec des résultats de RT-PCR équivoques/ambiguës en termes de courbe sigmoïde et de valeur Ct seront exclus.

   Les consentements des patients ne sont pas requis car le CRO recevra les échantillons de l'IEDCR conformément au protocole d'entente avec l'IEDCR. Il n'y a donc aucune exigence d'inscription et de consentement du patient et de CRF du côté CRO.

   3.7 Procédure de collecte de données : les échantillons positifs au COVID-19 seront confirmés par les résultats de laboratoire des résultats positifs de RT-PCR pour l'ARN viral.

   3.8 Analyse des données : La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative du kit de RT-PCR en temps réel BRiCM COVID-19 seront déterminées. Le test du chi carré (bilatéral) sera effectué pour comparer les variables catégorielles. Une valeur p ≤0,05 sera considérée comme le niveau d'association significative. Outre la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative, le coefficient Kappa, le rapport de vraisemblance positif et le rapport de vraisemblance négatif seront également calculés.

   3.9 La base de données est protégée contre tout accès non autorisé par des procédures de sécurité établies ; des copies de sauvegarde appropriées de la base de données et des fichiers logiciels connexes doivent être conservées. Les bases de données sont sauvegardées par l'administrateur de la base de données conjointement avec toute mise à jour ou modification de la base de données.

   3.10 L'investigateur doit rendre les données de l'étude accessibles au moniteur et aux représentants autorisés. L'investigateur doit fournir un rapport d'étude intermédiaire avec des données tous les trois mois à l'investigateur principal. Selon les exigences, le rapport d'étude et les données peuvent être fournis au Bangladesh Medical Research Council (BMRC) et à la Direction générale de l'administration des médicaments (DGDA). L'enquêteur doit s'assurer de la fiabilité et de la disponibilité des documents sources.

   3.11 Les visites de contrôle seront effectuées par l'investigateur principal, le co-investigateur ainsi que les représentants conformément aux lignes directrices pour les bonnes pratiques cliniques (BPC).

   3.12 Afin de maintenir la confidentialité des sujets, seuls un numéro de site, un numéro de sujet et les initiales du sujet identifieront tous les sujets de l'étude sur les formulaires d'enregistrement de cas (CRF) et d'autres documents soumis à l'investigateur. Les problèmes supplémentaires de confidentialité des sujets (le cas échéant) sont couverts dans l'accord d'étude clinique.

   3.13 Tous les dossiers seront gardés secrets pour le PI, les co-investigateurs, le sponsor, à l'exception des personnes responsables de l'IEDCR qui sont en charge. Les échantillons seront identifiés par le code/numéro d'identification et la date à l'IEDCR avant d'être envoyés à BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Pour cette étude, l'institut mentionné IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. a la capacité de mener l'essai clinique pour découvrir l'efficacité du kit grâce à leur ressource existante. En plus de cela, le CRO peut gérer le produit chimique, le réactif et la technologie, le cas échéant, nécessaires à l'étude conformément au protocole d'accord entre les agences de financement.

   5. Conflit d'intérêt BRiCM est l'agence de financement du kit RT-PCR COVID-19 proposé, est un organisme statutaire fonctionnant sous le contrôle administratif du ministère de la Science et de la Technologie. C'est un organisme de recherche et un institut de référence dans le domaine des mesures chimiques. Ce n'est ni une entreprise commerciale ni une organisation à but lucratif. Selon la sanction constitutionnelle, la responsabilité principale du BRiCM est de mener des recherches menant à une telle innovation qui ajoutera de la valeur à l'effort du gouvernement pour assurer le bien-être de la population.