Multiplex BangasureTM RT-PCR Kitin tehokkuus COVID-19:n havaitsemiseen (COVID-19)

Esittely:

Koronaviruksen COVID-19 pandemia on aikamme määrittelevä globaali terveyskriisi ja suurin haaste, joka on kohdattu toisen maailmansodan jälkeen. Pandemia on paljon enemmän kuin terveyskriisi; se on myös ennennäkemätön sosioekonominen kriisi. Sen jälkeen kun virus on tunnistettu Wuhanin alueella Kiinassa, virus ei ole vain levinnyt 213 maahan/alueelle 209 miljoonalla tapauksella ja 4,39 miljoonalla maailmanlaajuisesti, vaan se voi myös saada 400 miljoonaa ihmistä työttömäksi Kansainvälisen työjärjestön arvion mukaan.

Taudin leviämisen hillitsemiseksi eri puolilla maailmaa on käynnistetty monialaisia ​​strategioita, joihin kuuluu sosiaalisen etäisyyden toteuttaminen, henkilökohtaisen hygienian ylläpitäminen, kontaktien jäljitys sekä karanteenin, matkustusrajoitusten ja sulkujen toteuttaminen. Laajalti hyväksytty menetelmä on SARS-CoV-2-testaus, jossa käytetään tyypillisesti nenänielun vanupuikkonäytteitä. Positiivisiksi todetut potilaat tarvitsevat asianmukaista kliinistä hoitoa joko tehokkaalla eristyksellä tai karanteenilla kotona lievien oireiden vuoksi tai terveydenhuollon tiloissa keskivaikeiden tai vaikeiden oireiden vuoksi. Lisäksi laajamittaiset testaukset tarjoavat enemmän informatiivista epidemiologista tietoa tautien seurantaa ja valvontaa koskevien toimintatapojen laatimiseen. SARS-CoV-2-viruksen havaitsemiseksi nenänielun nesteistä on ehdotettu monia lähestymistapoja, kuten multipleksinen RT-PCR, CRISPR/Cas12 ja CRISPR-Cas3, lateraalivirtaus-immunomääritys, paperipohjaiset bimolekyylisensorit, SHERLOCK-testaus yhdessä astiassa, DNA-aptameeri , silmukkavälitteinen isoterminen vahvistus (LAMP) jne. Näistä menetelmistä nukleiinihappomonistukseen perustuvat testit ovat yleisimpiä SARS-CoV-2:n diagnosoinnissa.

Lisäksi US CDC ehdottaa protokollaa SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi, joka perustuu nukleokapsidigeenin kahden alueen, nimittäin N1:n ja N2:n, ja ihmisen sisäisen kontrolligeenin RNaasi P:n (RP) monistamiseen. Näiden strategioiden lisäksi ponnistelut SARS-CoV-2:n havaitsemismenetelmien kehittämiseksi korkean tehokkuuden ja tarkkuuden sekä pienemmällä reaktioajalla ja vaivalla ovat edelleen käynnissä.

Vaikka testausta pidetäänkin SARS CoV-2 -havainnon kultaisena standardina, testaus on jäänyt jälkeen monissa maissa useiden tekijöiden vuoksi, joista tärkeimpiä ovat toimitusketjuun liittyvät ongelmat, jotka liittyvät reagenssien ja riittävien testisarjojen puutteeseen. Siksi monet potilaat (sekä oireettomat että oireettomat) jäävät testaamatta ja voivat siten edistää viruksen leviämistä yhteisössä.

Jos Bangladesh pystyy valmistamaan omia RT-PCR-pakkauksia, joiden laatu ei ole huonompi herkkyyden, spesifisyyden jne. suhteen, se lieventäisi RT-PCR-sarjan pulaa, koska tutkijat ovat täysin riippuvaisia ​​tuoduista testisarjoista ja säästävät myös ulkomaan valuuttaa. Lisäksi RT-PCR-testisarjat ovat erittäin herkkiä lämpötilalle, ja niiden on säilytettävä kylmäketju sen laadun vuoksi, mitä voidaan lieventää kehittämällä paikallista RT PCR -pakkausta. Lisäksi monia SARS-CoV-2-variantteja on kehitetty mutaation vuoksi, joka on osoittanut enemmän virulenssia ja korkeaa siirtymisnopeutta. Joten uuden RT PCR -sarjan kehittäminen, joka pystyy havaitsemaan uudemman kannan, voi olla erittäin hyödyllistä.

Joten tässä tutkijan tavoitteena on kehittää kolmen geenin tunnistettavissa oleva vankka RT-PCR-sarja, joka on maa ensimmäinen ja antaa luotettavan tuloksen SARS-CoV-2-viruksen erilaisista varianteista sen tarttuvuuden vähentämiseksi ja ennaltaehkäisevän hoitosuunnitelman toteuttamiseksi 2. Tavoitteet tutkimus:

1. Yleiset tavoitteet: Ensisijaisina tavoitteina on kehittää multiplex reaaliaikainen käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (rRT-PCR) SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi.

2. Toissijaiset tavoitteet: Parhaan RT-PCR-suorituskyvyn saavuttamiseksi E- ja N-geenikohteiden yhdistelmä tulisi optimoida.

   3. Menetelmät: 3.1. Tutkimuksen tyyppi ja tarkoitus: Tämä on tapauskontrolli- ja havainnointitutkimus, jossa tunnistetaan ja verrataan kaksi olemassa olevaa jäädytettyä ja tuoretta näytettä.

   3.2. Opiskelupaikka:

   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR)
   • NEITI. Clinical Research Organisation Oy 3.3. Näytteiden keräyssivusto(t):
   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) tai
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Opintojen kesto: • 3 kuukautta (marraskuusta 2021 tammikuuhun 2022) Bangladeshin lääketieteellisen tutkimusneuvoston eettisen hyväksynnän saamisen jälkeen.

   3.5. Tutkimuspopulaatio/näytteen valinta 3.5.1 CRO saa testausnäytteet IEDCR:ltä. IEDCR:llä ja BCTL/CROL:lla CRO:na on yhteisymmärryspöytäkirja (MoU) erilaisista tutkimusyhteistyöstä. Joten NILMRC/BCTL/CROL saa yhteensä 120 näytettä IEDCR:ltä RT-PCR-sarjan tehokkuuden arvioimiseksi. 120 näytteestä 60 säilytetään näytettä (30 tunnettua COVID-19-positiivista ja 30 COVID-19-negatiivista näytettä), joita on säilytetty -80°C:n laboratoriopakastimissa IEDCR:n tiloissa, ja vielä 60 tuoretta näytettä (30 COVID-19-positiivista näytettä). ja 30 COVID-19-negatiivista näytettä), joita testataan IEDCR:ssä. Näytteet, joiden tulokset ovat ristiriitaisia, hylätään ennen testausta BRiCM RT PCR -sarjalla. Toisin sanoen yli 120 tunnistettua näytettä IEDCR:stä saatetaan tarvita analysoitavaksi tuoduilla RT-PCR-sarjoilla ja uuttosarjalla BCTL/CROL:ssa. Näin 120 näytettä valitaan BRiCM RT-PCR -sarjan suorituskyvyn arviointiin.

   3.5.2 Puolueettomuuden ja eturistiriitojen välttämiseksi sponsori ja PI/apututkijat sokennetaan näytteiden tunnistetiedot ja näytteiden positiivinen/negatiivinen tila ja potilaiden kliiniset tiedot. Sekä tallennettujen että tuoreiden näytteiden positiivinen/negatiivinen tila tunnistetaan IEDCR:ssä ennen lähettämistä BCTL/CROLiin. Toisin sanoen BCTL/CROL-henkilöstö sokkoutuu näytteen henkilöllisyystodistuksesta (ID) ja positiivisesta negatiivisesta/negatiivinen tilasta ennen analysointia. Lopuksi CRO-johtaja lähettää suorituskyvyn arviointitodistuksen PI:lle tai sponsorille.

   3.5.3. Otoskoon tilastollinen peruste:

   Kaavat:

   Tutkimus suoritetaan 120 osallistujalla (60 tallennettua tunnettua positiivista ja negatiivista ja 60 tuoretta tunnettua positiivista ja negatiivista). Halutun absoluuttisen tarkkuuden (n) saavuttamiseksi RT-PCR:n tehokkuuden arvioinnissa pienin näytekoko on arvioitu noudattamalla diskreettiä Bernoullin todennäköisyysfunktiota seuraavasti:

   Alfa = 5 % D = absoluuttinen tarkkuus (%) 95 % varmuudella. Haluttu absoluuttinen tarkkuus n D Alfa=5 % Z=1,96 10 30,99 % n D= (1,96)/(2* neliöjuuri (SQRT) (n)) 20 21,91 % 100 9,80 % 30 17,89 % 9420 8.0. 6,93 % 300 5,66 % 400 4,90 % 1000 3,10 % 10 000 0,98 % 20 000 0,69 % 30 000 0,57 % 100 000 0,3 % 3,6 näytteen valintakriteerit: CVID-arvo ≥ 3,6 näytteen valintakriteerit 1 RT 3-5-3. IEDCR:n geenit valitaan COVID-19-positiivisiksi. Näytteet, joiden RT-PCR-tulokset ovat negatiivisia ja jotka eivät ole monistaneet COVID-19-geenejä IEDCR:ssä, valitaan COVID-19:ksi.

   • Sukupuoli: Kaikki
   • Ikä: 5-70 vuotta (lapsi, aikuinen, vanhempi aikuinen) 7.8.2. Poissulkemiskriteerit
   • Näytteet, joiden RT-PCR-tulokset ovat epäselviä/epäselviä sigmoidikäyrän ja Ct-arvon suhteen, jätetään pois.

   Potilaiden suostumusta ei vaadita, koska CRO vastaanottaa näytteet IEDCR:ltä IEDCR:n kanssa tehdyn MOU:n mukaisesti. CRO:n puolelta ei siis vaadita potilaan ilmoittautumista, suostumuksia ja CRF:ää.

   3.7 Tiedonkeruumenettely: COVID-19-positiiviset näytteet vahvistetaan viruksen RNA:n positiivisilla RT-PCR-tuloksilla.

   3.8 Tietojen analyysi: BRiCM COVID-19 -reaaliaikaisen RT-PCR-sarjan herkkyys, spesifisyys, positiivinen ennustearvo ja negatiivinen ennustearvo määritetään. Khin-neliötesti (kaksipuolinen) suoritetaan kategoristen muuttujien vertailua varten. P-arvoa ≤0,05 pidetään merkittävän assosioinnin tasona. Herkkyyden, spesifisyyden, positiivisen ennustusarvon ja negatiivisen ennustusarvon ohella lasketaan myös Kappa-kerroin, positiivinen todennäköisyyssuhde ja negatiivinen todennäköisyyssuhde.

   3.9 Tietokanta on suojattu luvattomalta käytöltä vahvistetuin turvamenetelmin. Tietokannasta ja siihen liittyvistä ohjelmistotiedostoista on säilytettävä asianmukaiset varmuuskopiot. Tietokannan ylläpitäjä varmuuskopioi tietokannat tietokannan päivitysten tai muutosten yhteydessä.

   3.10 Tutkijan on asetettava tutkimustiedot monitorin ja valtuutettujen edustajien saataville. Tutkijan tulee toimittaa päätutkijalle kolmen kuukauden välein välitutkimusraportti, jossa on tiedot. Vaatimuksen mukaan tutkimusraportti ja tiedot voidaan toimittaa Bangladeshin lääketieteellisen tutkimuksen neuvostolle (BMRC) ja lääkehallinnon pääosastolle (DGDA). Tutkijan on varmistettava lähdeasiakirjojen luotettavuus ja saatavuus.

   3.11 Seurantakäyntejä tekevät päätutkija, apututkija sekä edustajat Good Clinical Practice (GCP) -ohjeiden mukaisesti.

   3.12 Aiheen luottamuksellisuuden säilyttämiseksi vain paikan numero, aihenumero ja aiheen nimikirjaimet tunnistavat kaikki tutkittavat kohteet Case Records Forms (CRF) -lomakkeissa ja muissa tutkijalle toimitetuissa asiakirjoissa. Muita aiheen luottamuksellisuutta koskevia kysymyksiä (tarvittaessa) käsitellään kliinisen tutkimuksen sopimuksessa.

   3.13 Kaikki tallenteet pidetään salassa PI:lle, yhteistutkijoille ja sponsorille lukuun ottamatta IEDCR:n vastuuhenkilöitä, jotka ovat vastuussa. Näytteet tunnistetaan koodina/ID-numerona ja päivämääränä IEDCR:ssä ennen lähettämistä BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4:lle. Tätä tutkimusta varten mainitulla instituutilla IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. suorittaa kliinisen tutkimuksen selvittääkseen pakkauksen tehokkuuden olemassa olevien resurssiensa avulla. Tämän lisäksi CRO voi hallita kemikaaleja, reagensseja ja teknologiaa, jos niitä tarvitaan tutkimukseen rahoittajien välisen yhteisymmärryspöytäkirjan mukaisesti.

   5. Eturistiriita BRiCM on ehdotetun COVID-19 RT-PCR -sarjan rahoittaja, lakisääteinen elin, joka toimii tiede- ja teknologiaministeriön hallinnollisessa valvonnassa. Se on tutkimusorganisaatio ja referenssilaitos kemiallisten mittausten alalla. Se ei ole kaupallinen yritys eikä voittoa tavoitteleva organisaatio. Perustuslaillisen seuraamuksen mukaan BRiCM:n päävastuu on jatkaa tutkimusta, joka johtaa sellaiseen innovaatioon, joka tuo lisäarvoa hallituksen pyrkimyksiin varmistaa ihmisten hyvinvointi.