Эффективность набора Multiplex Bangasure RT-PCR Kit для обнаружения COVID-19 (COVID-19)

Введение:

Пандемия коронирусного вируса COVID-19 является определяющим глобальным кризисом в области здравоохранения нашего времени и величайшей проблемой, с которой столкнулись со времен Второй мировой войны. Пандемия — это гораздо больше, чем кризис в области здравоохранения; это также беспрецедентный социально-экономический кризис. С момента его обнаружения в районе Уханя, Китай, вирус не только распространился по 213 странам/территориям с 209 миллионами случаев заболевания и 4,39 миллионами случаев во всем мире, но также может лишить работы 400 миллионов человек, по оценкам Международной организации труда.

Чтобы сдержать распространение болезни, в разных регионах мира были запущены междисциплинарные стратегии, включая реализацию социального дистанцирования, поддержание личной гигиены, отслеживание контактов и введение карантина, ограничений на поездки и блокировки. Широко распространенным методом является тестирование на SARS-CoV-2, обычно с использованием образцов мазка из носоглотки. Пациенты с положительным результатом теста нуждаются в надлежащем клиническом лечении путем эффективной изоляции или карантина дома при легких симптомах или в медицинских учреждениях при умеренных и тяжелых симптомах. Кроме того, широкомасштабное тестирование предоставляет более информативные эпидемиологические данные для разработки политики мониторинга и контроля заболеваний. Было предложено множество подходов для обнаружения вируса SARS-CoV-2 в носоглоточных жидкостях, таких как мультиплексная ОТ-ПЦР, CRISPR/Cas12 и CRISPR-Cas3, иммуноанализ с латеральным потоком, бимолекулярные сенсоры на бумажной основе, тестирование SHERLOCK в одном сосуде, ДНК-аптамер , петлевая изотермическая амплификация (LAMP) и др. Среди этих методов тесты на основе амплификации нуклеиновых кислот являются наиболее распространенными для диагностики SARS-CoV-2.

Кроме того, Центры по контролю и профилактике заболеваний США предлагают протокол для обнаружения SARS-CoV-2, основанный на амплификации двух областей нуклеокапсидного гена, а именно N1 и N2, и человеческого гена внутреннего контроля РНКазы P (RP). В дополнение к этим стратегиям все еще продолжаются усилия по разработке методов обнаружения SARS-CoV-2 с высокой эффективностью и точностью, с меньшим временем реакции и усилиями.

Однако, несмотря на то, что тестирование считается золотым стандартом для обнаружения SARS CoV-2, тестирование во многих странах отстает из-за различных факторов, наиболее важными из которых являются проблемы с цепочкой поставок из-за отсутствия реагентов и адекватных наборов для тестирования. Таким образом, многие пациенты (как с симптомами, так и без симптомов) остаются непроверенными и, следовательно, потенциально способствуют распространению вируса среди населения.

Если Бангладеш сможет производить свои собственные наборы для ОТ-ПЦР, не уступающие по качеству с точки зрения чувствительности, специфичности и т. д., это уменьшит дефицит набора для ОТ-ПЦР, поскольку исследователи полностью зависят от импортных наборов для тестирования, а также сэкономит иностранную валюту. Кроме того, тестовые наборы для ОТ-ПЦР очень чувствительны к температуре, и для их качества необходимо поддерживать холодовую цепь, что можно смягчить, разработав местный набор для ОТ-ПЦР. Кроме того, многие варианты SARS-CoV-2 были разработаны из-за мутации, которая показала большую вирулентность и высокую скорость передачи. Таким образом, разработка нового набора для ОТ-ПЦР, который может обнаруживать новый штамм, может быть чрезвычайно полезной.

Итак, здесь цель исследователя разработать надежный набор для ОТ-ПЦР с возможностью обнаружения трех генов, который будет первым в стране и даст надежные результаты по различным типам вариантов вируса SARS-CoV-2 для снижения его трансмиссивности и принятия плана профилактического лечения 2. Цели изучение:

1. Общие цели: основные цели направлены на разработку мультиплексной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (рРТ-ПЦР) для обнаружения SARS-CoV-2.

2. Второстепенные цели: Для достижения наилучших результатов ОТ-ПЦР необходимо оптимизировать комбинацию генов-мишеней E и N.

   3. Методология: 3.1. Тип и цель исследования: Это исследование случай-контроль и обсервационное исследование, в котором идентифицируются и сравниваются две существующие группы замороженных и свежих образцов.

   3.2. Место учебы:

   • Институт эпидемиологического контроля и исследований заболеваний (IEDCR)
   • РС. Организация клинических исследований ООО 3.3. Место(а) сбора проб:
   • Институт эпидемиологического контроля и исследований заболеваний (IEDCR) или
   • Национальный институт лабораторной медицины и справочного центра (NILMRC), Дакка, Бангладеш.

   3.4. Продолжительность обучения: • 3 месяца (с ноября 2021 г. по январь 2022 г.) после получения одобрения по этике от Совета медицинских исследований Бангладеш.

   3.5. Исследуемая популяция/отбор образцов 3.5.1 CRO получит образцы для тестирования от IEDCR. IEDCR и BCTL/CROL как CRO имеют меморандум о взаимопонимании (MoU) для различных совместных исследований. Таким образом, NILMRC/BCTL/CROL получит в общей сложности 120 образцов от IEDCR для оценки эффективности набора ОТ-ПЦР. Из 120 образцов 60 будут храниться (30 заведомо положительных на COVID-19 и 30 отрицательных на COVID-19), которые хранились в лабораторных морозильных камерах при температуре -80°C в учреждениях IEDCR, и еще 60 свежих образцов (30 положительных на COVID-19). и 30 отрицательных образцов на COVID-19), которые тестируются в IEDCR. Образцы с противоречивыми результатами будут отклонены до тестирования с помощью набора BRiCM RT PCR. То есть может потребоваться более 120 идентифицированных образцов из IEDCR для анализа с помощью импортированных наборов для ОТ-ПЦР и набора для выделения из BCTL/CROL. Таким образом будут отобраны 120 образцов для оценки эффективности набора BRiCM RT-PCR.

   3.5.2 Чтобы избежать предвзятости и конфликта интересов, спонсор и PI/co-исследователи не будут знать идентификатор образца и положительный/отрицательный статус образцов и истории болезни пациентов. Положительный/отрицательный статус как сохраненных, так и свежих образцов будет определен в IEDCR перед отправкой в ​​BCTL/CROL. То есть персонал BCTL/CROL также не будет знать образца документа, удостоверяющего личность (ID), и положительного отрицательного/отрицательного статуса перед анализом. Наконец, руководитель CRO отправит сертификат оценки эффективности PI или Спонсору.

   3.5.3. Статистическая основа размера выборки:

   Формулы:

   Исследование проводится на 120 участниках (60 известных положительных и отрицательных результатов и 60 новых известных положительных и отрицательных результатов). Для достижения желаемой абсолютной точности (n) при оценке эффективности ОТ-ПЦР минимальный размер выборки оценивается в соответствии с дискретной функцией вероятности Бернулли следующим образом:

   Альфа = 5% D = абсолютная точность (%) с достоверностью 95%. Требуемая абсолютная точность n D Альфа = 5 % Z = 1,96 10 30,99 % n D = (1,96)/(2* Квадратный корень (SQRT) (n)) 20 21,91 % 100 9,80 % 30 17,89 % 120 8,94 % 100 9,80 % 200 6,93% 300 5,66% 400 4,90% 1000 3,10% 10000 0,98% 20000 0,69% 30000 0,57% 100000 0,3% гены в IEDCR будут отобраны как положительные на COVID-19. Образцы с отрицательными результатами ОТ-ПЦР без амплификации генов COVID-19 в IEDCR будут отобраны как COVID-19.

   • Пол: Все
   • Возраст: от 5 до 70 лет (дети, взрослые, пожилые люди) 7.8.2. Критерий исключения
   • Образцы с двусмысленными/неоднозначными результатами ОТ-ПЦР с точки зрения сигмоидальной кривой и значения Ct будут исключены.

   Согласие пациентов не требуется, поскольку CRO получит образцы от IEDCR в соответствии с Меморандумом о взаимопонимании с IEDCR. Таким образом, нет необходимости в регистрации и согласии пациента и CRF со стороны CRO.

   3.7 Процедура сбора данных. Положительные образцы на COVID-19 будут подтверждены лабораторными данными о положительных результатах ОТ-ПЦР на вирусную РНК.

   3.8 Анализ данных. Будет определена чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность набора BRiCM COVID-19 для ОТ-ПЦР в реальном времени. Тест хи-квадрат (двусторонний) будет выполняться для сравнения категориальных переменных. Значение p ≤0,05 будет рассматриваться как уровень значимой связи. Наряду с чувствительностью, специфичностью, положительной прогностической ценностью и отрицательной прогностической ценностью также будут рассчитываться коэффициент Каппа, положительное отношение правдоподобия и отрицательное отношение правдоподобия.

   3.9 База данных защищена от несанкционированного доступа установленными процедурами безопасности; должны поддерживаться соответствующие резервные копии базы данных и соответствующих файлов программного обеспечения. Базы данных резервируются администратором базы данных вместе с любыми обновлениями или изменениями в базе данных.

   3.10 Исследователь должен сделать данные исследования доступными для наблюдателя и уполномоченных представителей. Исследователь должен предоставлять промежуточный отчет об исследовании с данными каждые три месяца главному исследователю. В соответствии с требованиями отчет об исследовании и данные могут быть предоставлены Бангладешскому совету медицинских исследований (BMRC) и Генеральному управлению по лекарственным средствам (DGDA). Следователь должен обеспечить достоверность и доступность первичных документов.

   3.11 Визиты для мониторинга будут проводиться главным исследователем, соисследователем, а также представителями в соответствии с Руководством по надлежащей клинической практике (GCP).

   3.12 В целях сохранения конфиденциальности субъекта только номер учреждения, номер субъекта и его инициалы будут идентифицировать всех субъектов исследования в формах истории болезни (CRF) и другой документации, представленной исследователю. Дополнительные вопросы конфиденциальности предмета (если применимо) рассматриваются в Соглашении о клиническом исследовании.

   3.13 Все записи будут храниться в секрете для PI, со-исследователей, спонсора, за исключением ответственных лиц IEDCR, которые несут ответственность. Образцы будут идентифицированы как код/идентификационный номер и дата в IEDCR перед отправкой в ​​BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) 4. Для этого исследования упомянутый институт IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. имеет возможность провести клиническое испытание, чтобы выяснить эффективность набора с помощью имеющихся ресурсов. Кроме того, CRO может управлять химикатами, реагентами и технологиями, если они необходимы для исследования, в соответствии с Меморандумом о взаимопонимании между финансирующими агентствами.

   5. Конфликт интересов BRiCM является агентством, финансирующим предлагаемый набор для ОТ-ПЦР на COVID-19, и является уставным органом, действующим под административным контролем Министерства науки и технологий. Это исследовательская организация и эталонный институт в области химических измерений. Это не коммерческое предприятие и не коммерческая организация. В соответствии с конституционной санкцией основная обязанность BRiCM заключается в проведении исследований, ведущих к таким инновациям, которые повысят ценность усилий правительства по обеспечению благосостояния людей.