COVID-19 검출을 위한 Multiplex Bangasure™ RT-PCR 키트의 효능 (COVID-19)

소개:

코로나 바이러스 COVID-19 팬데믹은 우리 시대의 정의적인 글로벌 보건 위기이자 2차 세계 대전 이후 직면한 가장 큰 도전입니다. 팬데믹은 건강 위기 그 이상입니다. 전례 없는 사회경제적 위기이기도 하다. 중국 우한 지역에서 확인된 이후 바이러스는 213개 국가/영토에 걸쳐 2억 900만 건, 전 세계적으로 439만 건이 퍼졌을 뿐만 아니라 국제노동기구(ILO)의 추정에 따라 4억 명이 일자리를 잃을 수 있습니다.

질병의 확산을 막기 위해 사회적 거리두기, 개인위생 유지, 접촉자 추적, 검역, 여행 제한, 봉쇄 등 세계 여러 지역에서 종합적인 전략이 시작되었습니다. 널리 받아들여지는 방법은 일반적으로 비인두 면봉 표본을 활용하는 SARS-CoV-2 검사입니다. 양성 판정을 받은 환자는 경미한 증상의 경우 집에서, 중등도 내지 중증의 경우 의료 시설 내에서 효과적인 격리 또는 검역을 통해 적절한 임상 관리가 필요합니다. 또한 광범위한 테스트는 질병 모니터링 및 제어에 대한 정책 초안을 작성하는 데 더 유익한 역학 데이터를 제공합니다. 멀티플렉스 RT-PCR, CRISPR/Cas12 및 CRISPR-Cas3, 측면 흐름 면역분석법, 종이 기반 이분자 센서, 원팟 내 SHERLOCK 테스트, DNA 앱타머와 같은 비인두액에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하기 위한 많은 접근법이 제안되었습니다. , 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 등 이러한 방법 중 핵산 증폭 기반 검사는 SARS-CoV-2 진단에 가장 일반적입니다.

또한, 미국 CDC는 뉴클레오캡시드 유전자의 두 영역, 즉 N1 및 N2와 인간 내부 제어 유전자인 RNase P(RP)의 증폭을 기반으로 SARS-CoV-2 검출을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이러한 전략 외에도 반응 시간과 노력은 줄이면서 효율성과 정확도가 높은 SARS-CoV-2 탐지 방법을 개발하려는 노력이 계속되고 있습니다.

그러나 SARS CoV-2 탐지의 황금 표준으로 간주되고 있음에도 불구하고 다양한 요인으로 인해 많은 국가에서 테스트가 뒤쳐져 있습니다. 가장 중요한 것은 시약 및 적절한 테스트 키트 부족으로 인한 공급망 문제입니다. 따라서 많은 환자(유증상 및 무증상 모두)가 검사를 받지 않은 상태로 남아 있어 바이러스의 지역사회 확산에 잠재적으로 기여하고 있습니다.

방글라데시가 민감도, 특이도 등에서 품질면에서 뒤지지 않는 자체 RT-PCR 키트를 생산할 수 있다면 조사자들이 수입 테스트 키트에 전적으로 의존하고 있기 때문에 RT-PCR 키트 부족을 완화하고 외화도 절약할 수 있습니다. 또한 RT-PCR 테스트 키트는 온도에 매우 민감하며 로컬 RT PCR 키트를 개발하여 완화할 수 있는 품질을 위해 저온 유통을 유지해야 합니다. 또한 돌연변이로 인해 SARS-CoV-2의 많은 변종이 개발되어 더 많은 독성과 높은 전염률을 보였습니다. 따라서 새로운 균주를 검출할 수 있는 새로운 RT PCR kit의 개발이 큰 도움이 될 수 있습니다.

그래서 여기 연구자의 목표는 SARS-CoV-2 바이러스의 전염성을 줄이고 예방 관리 계획을 세우기 위해 국내 최초로 3가지 유전자 검출이 가능한 강력한 RT-PCR 키트를 개발하고 다양한 변종 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것입니다. 2. 목적 의 목적 연구:

1. 일반 목표: 기본 목표는 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 다중 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(rRT-PCR)을 개발하는 것을 목표로 합니다.

2. 2차 목표: 최상의 RT-PCR 성능을 위해서는 E 및 N 유전자 표적의 조합을 최적화해야 합니다.

   3. 방법론: 3.1. 연구 유형 및 목적: 기존의 냉동 샘플과 신선한 샘플 두 그룹을 식별하고 비교하는 사례 제어 및 관찰 연구입니다.

   3.2. 학습 장소:

   • 연구소 역학 질병 통제 및 연구 (IEDCR)
   • M/S. 임상 연구 조직 회사 3.3. 샘플 수집 사이트:
   • 연구소 역학 질병 통제 및 연구(IEDCR) 또는
   • 방글라데시 다카 국립 진단검사의학 및 추천 센터(NILMRC) 연구소.

   3.4. 연구 기간: • 방글라데시 의학 연구 위원회로부터 윤리적 허가를 받은 후 3개월(2021년 11월 ~ 2022년 1월).

   3.5. 연구 모집단/샘플 선택 3.5.1 CRO는 IEDCR로부터 테스트 샘플을 받습니다. CRO로서 IEDCR과 BCTL/CROL은 서로 다른 공동 연구 작업에 대한 양해각서(MoU)를 가지고 있습니다. 따라서 NILMRC/BCTL/CROL은 RT-PCR 키트 효율성 평가를 위해 IEDCR로부터 총 120개의 샘플을 받게 됩니다. 120개의 샘플 중 60개는 IEDCR 시설의 -80°C 실험실 냉동고에 보관된 샘플(30개의 COVID-19 양성 샘플 및 30개의 COVID-19 음성 샘플)과 다른 60개의 신선한 샘플(30개의 COVID-19 양성 샘플)입니다. 및 30개의 COVID-19 음성 샘플)이 IEDCR에서 테스트되고 있습니다. 결과가 일치하지 않는 샘플은 BRiCM RT PCR 키트로 테스트하기 전에 거부됩니다. 즉, BCTL/CROL에서 가져온 RT-PCR 키트 및 추출 키트로 분석하려면 IEDCR에서 확인된 120개 이상의 샘플이 필요할 수 있습니다. BRiCM RT-PCR 키트의 성능 평가를 위해 이렇게 120개의 샘플을 선별하게 됩니다.

   3.5.2 편견과 이해 상충을 피하기 위해 후원자와 PI/공동 조사자는 샘플 ID와 샘플의 양성/음성 상태 및 환자의 임상 기록에 대해 눈이 멀게 됩니다. 보관된 샘플과 신선한 샘플의 양성/음성 상태는 BCTL/CROL로 보내기 전에 IEDCR에서 식별됩니다. 즉, BCTL/CROL 직원은 분석 전에 샘플 신원 문서(ID)와 양성 음성/음성 상태에 대해 눈이 멀게 됩니다. 마지막으로 CRO 헤드는 성과 평가 인증서를 PI 또는 스폰서에게 보냅니다.

   3.5.3. 표본 크기의 통계적 근거:

   방식:

   이 연구는 120명의 참가자(저장된 60명의 양성 및 음성 및 60명의 새로운 양성 및 음성)를 대상으로 수행되었습니다. RT-PCR의 효율성을 추정할 때 원하는 절대 정확도(n)를 달성하기 위해 다음과 같이 이산 베르누이 확률 함수에 따라 추정되는 최소 샘플 크기:

   Alfa= 5% D= 95% 신뢰도의 절대 정확도(%). 원하는 절대 정확도 n D Alfa=5% Z=1.96 10 30.99% n D= (1.96)/(2* 제곱근(SQRT) (n)) 20 21.91% 100 9.80% 30 17.89% 120 8.94% 100 9.80% 200 6.93% 300 5.66% 400 4.90% 1000 3.10% 10000 0.98% 20000 0.69% 30000 0.57% 100000 0.3% 3.6 샘플 선택 기준 3.6.1 포함 기준: COVID-19에 대한 Ct 값≤35인 양성 샘플 IEDCR의 유전자는 COVID-19 양성으로 선택됩니다. IEDCR에서 COVID-19 유전자에 대한 증폭 없이 음성 RT-PCR 결과를 가진 샘플이 COVID-19로 선택됩니다.

   • 성별: 모두
   • 연령: 5~70세(어린이, 성인, 노인) 7.8.2. 제외 기준
   • S자형 곡선 및 Ct 값 측면에서 모호한/모호한 RT-PCR 결과가 있는 샘플은 제외됩니다.

   CRO는 IEDCR과의 MOU에 따라 IEDCR로부터 표본을 받기 때문에 환자의 동의가 필요하지 않습니다. 따라서 CRO 측의 환자 등록 및 동의 및 CRF에 대한 요구 사항이 없습니다.

   3.7 데이터 수집 절차: COVID-19 양성 샘플은 바이러스 RNA에 대한 양성 RT-PCR 결과의 실험실 결과에 의해 확인됩니다.

   3.8 데이터 분석: BRiCM COVID-19 실시간 RT-PCR 키트의 민감도, 특이도, 양성 예측값 및 음성 예측값이 결정됩니다. 범주형 변수를 비교하기 위해 카이제곱 검정(양면)이 수행됩니다. ≤0.05의 p 값은 유의미한 연관성 수준으로 간주됩니다. 민감도, 특이도, 양성 예측값 및 음성 예측값과 함께 Kappa 계수, 양성 우도비 및 음성 우도비도 계산됩니다.

   3.9 데이터베이스는 확립된 보안 절차에 따라 무단 액세스로부터 보호됩니다. 데이터베이스 및 관련 소프트웨어 파일의 적절한 백업 사본을 유지 관리해야 합니다. 데이터베이스는 데이터베이스에 대한 업데이트 또는 변경 사항과 함께 데이터베이스 관리자가 백업합니다.

   3.10 조사자는 모니터 및 승인된 대리인이 연구 데이터에 액세스할 수 있도록 해야 합니다. 시험자는 3개월 간격으로 데이터가 포함된 중간 연구 보고서를 주 시험자에게 제공해야 합니다. 요구 사항에 따라 연구 보고서 및 데이터가 Bangladesh Medical Research Council(BMRC) 및 Directorate General of Drug Administration(DGDA)에 제공될 수 있습니다. 조사관은 원본 문서의 신뢰성과 가용성을 보장해야 합니다.

   3.11 모니터링 방문은 GCP(Good Clinical Practice)에 대한 지침에 따라 주 시험자, 공동 시험자 및 대표자에 의해 수행됩니다.

   3.12 피험자 기밀 유지를 위해 사이트 번호, 피험자 번호 및 피험자 이니셜만 사례 기록 양식(CRF) 및 조사자에게 제출된 기타 문서에서 모든 연구 피험자를 식별합니다. 추가 피험자 기밀성 문제(해당하는 경우)는 임상 연구 계약에서 다룹니다.

   3.13 IEDCR 담당자를 제외한 모든 기록은 PI, 공동 조사자, 후원자에게 비밀로 유지됩니다. 샘플은 BCTL/CROL(Contact Research Organization Limited) 4로 보내기 전에 IEDCR에서 코드/ID 번호 및 날짜로 식별됩니다. 이 연구를 위해 언급된 기관 IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited(BTCL)/CRO Ltd.는 기존 리소스를 통해 키트의 효능을 확인하기 위해 임상 시험을 수행합니다. 그 외에도 CRO는 자금 조달 기관 간의 MoU에 따라 연구에 필요한 경우 화학 물질, 시약 및 기술을 관리할 수 있습니다.

   5. 이해 상충 BRiCM은 제안된 COVID-19 RT-PCR 키트의 자금 지원 기관이며 과학 기술부의 행정 통제하에 기능하는 법정 기관입니다. 화학 측정 분야의 연구 기관이자 참고 기관입니다. 그것은 영리 기업도 아니고 영리 조직도 아닙니다. 헌법 제재에 따르면 BRiCM의 주요 책임은 국민의 복지를 보장하기 위한 정부 노력에 가치를 더할 혁신으로 이어지는 연구를 수행하는 것입니다.