Effektiviteten av ett Multiplex BangasureTM RT-PCR-kit för upptäckt av covid-19 (COVID-19)

Introduktion:

Corona-viruset COVID-19-pandemin är vår tids avgörande globala hälsokris och den största utmaningen som har stått inför sedan andra världskriget. Pandemin är mycket mer än en hälsokris; det är också en aldrig tidigare skådad socioekonomisk kris. Sedan dess identifiering i regionen Wuhan, Kina, har inte bara viruset spridit sig över 213 länder/territorier med 209 miljoner fall och 4,39 miljoner globalt, utan kan också göra att 400 miljoner människor blir arbetslösa som Internationella arbetsorganisationen uppskattar.

För att begränsa spridningen av sjukdomar har multidisciplinära strategier lanserats i olika regioner i världen, inklusive implementering av social distansering, upprätthållande av personlig hygien, kontaktspårning och implementering av karantän, resebegränsningar och låsningar. En allmänt accepterad metod är att testa för SARS-CoV-2, vanligtvis med användning av nasofaryngeala pinnprover. Patienter som testats positiva kräver lämplig klinisk behandling genom antingen effektiv isolering eller karantän hemma för milda symtom eller inom vårdinrättningar för måttliga till svåra symtom. Dessutom ger storskaliga tester mer informativa epidemiologiska data för utarbetande av policyer för sjukdomsövervakning och kontroll. Många tillvägagångssätt har föreslagits för att detektera SARS-CoV-2-virus i nasofaryngeala vätskor såsom multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 och CRISPR-Cas3, lateral flow immunoassay, pappersbaserade bimolekylära sensorer, SHERLOCK-testning i en kruka, DNA-aptamer , loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP), etc. Bland dessa metoder är nukleinsyraamplifieringsbaserade tester de vanligaste för diagnosen SARS-CoV-2.

Dessutom föreslår US CDC ett protokoll för detektion av SARS-CoV-2, baserat på amplifiering av två regioner av nukleokapsidgenen, nämligen N1 och N2, och en human intern kontrollgen RNase P (RP). Utöver dessa strategier pågår fortfarande ansträngningar för att utveckla SARS-CoV-2-detektionsmetoder med hög effektivitet och precision, med mindre reaktionstid och ansträngning.

Men trots att de anses vara guldstandarden för SARS CoV-2-detektion har testning släpat efter i många länder på grund av olika faktorer, de viktigaste är problem med leveranskedjan med brist på reagenser och adekvata testkit. Därför förblir många patienter (både symtomatiska och asymtomatiska) oprövade och bidrar därför potentiellt till spridning av viruset i samhället.

Om Bangladesh kan producera sina egna RT-PCR-kit som inte är sämre i kvalitet vad gäller sensitivitet, specificitet etc. skulle det mildra bristen på RT-PCR-kit då utredarna är helt beroende av importerade testkit och även sparar utländsk valuta. Dessutom är RT-PCR-testkit mycket temperaturkänsliga och behöver bibehålla kylkedjan för dess kvalitet, vilket kan mildras genom att utveckla ett lokalt RT PCR-kit. Dessutom har många varianter av SARS-CoV-2 utvecklats på grund av mutation, vilket har visat mer virulens och hög överföringshastighet. Så utveckling av ett nytt RT PCR-kit som kan upptäcka nyare stam kan vara extremt användbart.

Så här utredarens mål att utveckla de tre gener detekterbara robusta RT-PCR-kit som kommer att vara landet först och ge tillförlitliga resultat av olika typer av varianter av SARS-CoV-2-virus för att minska dess överföringsförmåga och ta förebyggande hanteringsplan 2. Mål för studien:

1. Allmänna mål: Primära mål är inriktade på att utveckla multiplex realtids omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (rRT-PCR) för att detektera SARS-CoV-2.

2. Sekundära mål: För bästa RT-PCR-prestanda bör kombinationen av E- och N-genmål optimeras.

   3. Metod: 3.1. Studietyp och syfte: Detta är en fallkontroll- och observationsstudie där två befintliga grupper frysta och färska prover identifieras och jämförs.

   3.2. Studieplats:

   • Institutet för epidemiologisk sjukdomskontroll och forskning (IEDCR)
   • FRÖKEN. Clinical Research Organisation Ltd 3.3. Provinsamlingsplats(er):
   • Institutet Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) eller
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dhaka, Bangladesh.

   3.4. Studiens varaktighet: • 3 månader (november 2021 till januari 2022) efter att ha fått etiskt tillstånd från Bangladesh Medical Research Council.

   3.5. Studiepopulation/urval 3.5.1 CRO kommer att få testprover från IEDCR. IEDCR och BCTL/CROL som CRO har memorandum of understanding (MoU) för olika forskningssamarbeten. Så, NILMRC/BCTL/CROL kommer att få totalt 120 prov från IEDCR för utvärdering av RT-PCR-kiteffektiviteten. Av de 120 proverna kommer 60 att lagras prover (30 covid-19 kända positiva och 30 covid-19 negativa prover) som har förvarats i -80°C labbfrysar vid IEDCR-anläggningar och ytterligare 60 färska prover (30 covid-19 positiva) och 30 COVID-19-negativa prover) som testas på IEDCR. Prover med disharmoniska resultat kommer att avvisas före testning med BRiCM RT PCR-kit. Det vill säga, mer än 120 identifierade prover från IEDCR kan behövas för att analysera med importerade RT-PCR-kit och extraktionssats vid BCTL/CROL. Så här kommer 120 prover att väljas ut för prestandautvärdering av BRiCM RT-PCR-kit.

   3.5.2 För att undvika partiskhet och intressekonflikter kommer sponsorn och PI/medutredarna att bli blinda för provets ID och positiva/negativa status för proverna och patienternas kliniska journaler. Den positiva/negativa statusen för både lagrade och färska prover kommer att identifieras vid IEDCR innan de skickas till BCTL/CROL. Det vill säga, BCTL/CROL-personal kommer också att bli blind för provets identitetsdokument (ID) och positiv negativ/negativ status före analys. Slutligen kommer CRO-chefen att skicka prestationsutvärderingscertifikatet till PI eller sponsor.

   3.5.3. Statistisk grund för provstorlek:

   Formler:

   Studien genomförs på 120 deltagare (60 lagrade kända positiva & negativa och 60 färska kända positiva & negativa). För att uppnå önskad absolut noggrannhet (n) vid uppskattning av effektiviteten av RT-PCR den minsta provstorleken uppskattad efter att följa den diskreta Bernoullis sannolikhetsfunktion enligt följande:

   Alfa= 5 % D= absolut noggrannhet (%) med 95 % konfidens. Önskad absolut noggrannhet n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* kvadratrot (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 1009 1009 120 8% 6,93 % 300 5,66 % 400 4,90 % 1 000 3,10 % 10 000 0,98 % 20 000 0,69 % 30 000 0,57 % 100 000 0,3 % 3,6 Sample Urvalskriterier 1 C. 3 Resultat 6 Provtagningskriterier 1 C. 3 Resultat 3.6 Provtagningskriterier 1 3. gener hos IEDCR kommer att väljas ut som covid-19-positiva. Prover med negativa RT-PCR-resultat utan amplifiering för COVID-19-generna vid IEDCR kommer att väljas som COVID-19.

   • Kön: Alla
   • Ålder: 5 till 70 år (barn, vuxen, äldre vuxen) 7.8.2. Exklusions kriterier
   • Prover med tvetydiga/tvetydiga RT-PCR-resultat i form av sigmoidal kurva och Ct-värde kommer att exkluderas.

   Samtycke från patienterna krävs inte eftersom CRO kommer att ta emot proverna från IEDCR enligt MOU med IEDCR. Så det finns inget krav på patientens inskrivning och samtycke och CRF från CRO-sidan.

   3.7 Datainsamlingsprocedur: COVID-19-positiva prover kommer att bekräftas av laboratoriefynd av positiva RT-PCR-resultat för det virala RNA:t.

   3.8 Dataanalys: Känsligheten, specificiteten, positivt prediktivt värde och negativt prediktivt värde för BRiCM COVID-19 realtids RT-PCR-kit kommer att bestämmas. Chi-kvadrattestet (tvåsidigt) kommer att utföras för att jämföra kategoriska variabler. Ett p-värde på ≤0,05 kommer att betraktas som nivån för signifikant association. Vid sidan av sensitivitet, specificitet, positivt prediktivt värde och negativt prediktivt värde, kommer även Kappa-koefficient, positivt sannolikhetsförhållande och negativt sannolikhetsförhållande att beräknas.

   3.9 Databasen skyddas mot obehörig åtkomst genom etablerade säkerhetsprocedurer; Lämpliga säkerhetskopior av databasen och tillhörande programvarufiler ska behållas. Databaser säkerhetskopieras av databasadministratören i samband med eventuella uppdateringar eller ändringar av databasen.

   3.10 Utredaren måste göra studiedata tillgänglig för monitorn och auktoriserade representanter. Utredaren måste tillhandahålla en interimsstudierapport med data var tredje månad till huvudutredaren. Enligt krav kan studierapport och data lämnas till Bangladesh Medical Research Council (BMRC) och General Directorate of Drug Administration (DGDA). Utredaren måste säkerställa tillförlitligheten och tillgängligheten för källdokument.

   3.11 Övervakningsbesök kommer att genomföras av huvudutredare, medutredare samt representanterna enligt riktlinjerna för god klinisk praxis (GCP).

   3.12 För att upprätthålla ämnets konfidentialitet kommer endast ett platsnummer, ämnesnummer och ämnesinitialer att identifiera alla studieämnen på Case Records Forms (CRF) och annan dokumentation som skickas till utredaren. Ytterligare frågor om ämnessekretess (om tillämpligt) täcks av avtalet om kliniska studier.

   3.13 Alla register kommer att hållas hemliga för PI, medutredare, sponsor utom IEDCR-ansvariga personer som är ansvariga. Prover kommer att identifieras som kod/ID-nummer och datum hos IEDCR innan de skickas till BCTL/Contact Research Organisation Limited (CROL) 4. För denna studie har det nämnda institutet IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. förmågan att genomföra den kliniska prövningen för att ta reda på effekten av kitet genom deras befintliga resurs. Utöver det kan CRO hantera kemikalier, reagens och teknologi om det behövs för studien enligt MoU mellan finansieringsorgan.

   5. Intressekonflikt BRiCM är finansieringsorganet för det föreslagna COVID-19 RT-PCR-kit, är ett lagstadgat organ som fungerar under administrativ kontroll av ministeriet för vetenskap och teknik. Det är en forskningsorganisation och ett referensinstitut inom området kemiska mätningar. Det är varken ett kommersiellt företag eller en vinstdrivande organisation. Enligt konstitutionella sanktioner är BRiCMs huvudansvar att bedriva forskning som leder till sådan innovation som kommer att ge ett mervärde till regeringens insatser för att säkerställa folkets välfärd.