A Multiplex BangasureTM RT-PCR készlet hatékonysága a COVID-19 kimutatására (COVID-19)

Bevezetés:

A koronavírus COVID-19 világjárvány korunk meghatározó globális egészségügyi válsága és a második világháború óta a legnagyobb kihívás. A világjárvány sokkal több, mint egészségügyi válság; ez egyben példátlan társadalmi-gazdasági válság is. A kínai Wuhan régióban történt azonosítása óta a vírus nemcsak 213 országban/területen terjedt el 209 millió megbetegedéssel és 4,39 millióval világszerte, hanem a Nemzetközi Munkaügyi Szervezet becslései szerint 400 millió embert is kiszoríthat az állásából.

A betegségek terjedésének megfékezése érdekében a világ különböző régióiban multidiszciplináris stratégiákat indítottak el, beleértve a társadalmi távolságtartás megvalósítását, a személyes higiénia betartását, az érintkezések nyomon követését, valamint karantén, utazási korlátozások és elzárások bevezetését. Széles körben elfogadott módszer a SARS-CoV-2 vizsgálata, jellemzően nasopharyngealis tamponminták felhasználásával. A pozitív eredményt mutató betegek megfelelő klinikai kezelést igényelnek, hatékony elkülönítéssel vagy otthoni karanténnal enyhe tünetek esetén, vagy egészségügyi intézményekben közepesen súlyos vagy súlyos tünetek esetén. Ezen túlmenően a széleskörű tesztelés informatívabb epidemiológiai adatokat biztosít a betegségek megfigyelésére és ellenőrzésére vonatkozó irányelvek kidolgozásához. Számos megközelítést javasoltak a SARS-CoV-2 vírus nasopharyngealis folyadékokban történő kimutatására, például multiplex RT-PCR, CRISPR/Cas12 és CRISPR-Cas3, laterális áramlási immunoassay, papíralapú bimolekuláris érzékelők, SHERLOCK-teszt egy edényben, DNS-aptamer , hurok közvetített izoterm amplifikáció (LAMP) stb. Ezen módszerek közül a nukleinsav-amplifikáción alapuló tesztek a leggyakoribbak a SARS-CoV-2 diagnosztizálására.

Ezenkívül az US CDC a nukleokapszid gén két régiójának, nevezetesen az N1-nek és az N2-nek, valamint az RNáz P (RP) humán belső kontrollgénnek az amplifikációján alapuló protokollt javasol a SARS-CoV-2 kimutatására. Ezeken a stratégiákon túlmenően továbbra is folynak a SARS-CoV-2 nagy hatékonyságú és pontosságú, kevesebb reakcióidőt és erőfeszítést igénylő kimutatási módszerek kifejlesztésére irányuló erőfeszítések.

Mindazonáltal annak ellenére, hogy a SARS CoV-2 kimutatásának aranystandardjának tekintik, a tesztelés számos országban lemaradt különböző tényezők miatt, amelyek közül a legfontosabbak az ellátási lánc problémái a reagensek és a megfelelő tesztkészletek hiányával. Ezért sok beteg (mind tünetmentes, mind tünetmentes) marad teszteletlen, és így potenciálisan hozzájárul a vírus közösségi terjedéséhez.

Ha Banglades saját RT-PCR készleteket tud gyártani, amelyek minősége nem alacsonyabb érzékenység, specifitás stb. tekintetében, az mérsékelné az RT-PCR készlet hiányát, mivel a vizsgálók teljes mértékben az importált tesztkészletektől függenek, és devizát takarítanak meg. Ezenkívül az RT-PCR tesztkészletek nagyon érzékenyek a hőmérsékletre, és meg kell őrizniük a hideglánc minőségét, ami csökkenthető a helyi RT PCR készlet fejlesztésével. Ezenkívül a SARS-CoV-2 számos változatát fejlesztették ki a mutáció miatt, amely nagyobb virulenciát és magas átviteli sebességet mutatott. Tehát rendkívül hasznos lehet egy új RT PCR készlet kifejlesztése, amely képes az újabb törzsek kimutatására.

Tehát itt a vizsgáló célja a három génben kimutatható robusztus RT-PCR készlet kifejlesztése, amely országelső lesz, és megbízható eredményt ad a SARS-CoV-2 vírus különböző változatairól annak átvitelének csökkentése és a megelőző kezelési terv végrehajtása érdekében 2. a tanulmány:

1. Általános célok: Az elsődleges célkitűzések multiplex valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (rRT-PCR) kifejlesztése a SARS-CoV-2 kimutatására.

2. Másodlagos célok: A legjobb RT-PCR teljesítmény érdekében az E és N gén célpontjainak kombinációját optimalizálni kell.

   3. Módszertan: 3.1. A vizsgálat típusa és célja: Ez egy esetkontroll és megfigyeléses vizsgálat, amelyben két meglévő csoport fagyasztott és friss mintákat azonosítanak és hasonlítanak össze.

   3.2. Tanulás helye:

   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR)
   • KISASSZONY. Klinikai Kutatási Szervezet Zrt. 3.3. Mintagyűjtő hely(ek):
   • Institute Epidemiology Disease Control and Research (IEDCR) ill
   • National Institute of Laboratory Medicine & Referral Center (NILMRC), Dhaka, Banglades.

   3.4. A tanulmány időtartama: • 3 hónap (2021. novembertől 2022. januárig) a Bangladeshi Orvosi Kutatási Tanács etikai engedélyének megszerzése után.

   3.5. Vizsgálat Populáció/minta kiválasztása 3.5.1 A CRO vizsgálati mintákat kap az IEDCR-től. Az IEDCR és a BCTL/CROL mint CRO egyetértési nyilatkozattal (MoU) rendelkezik a különböző együttműködési kutatási munkákról. Tehát a NILMRC/BCTL/CROL összesen 120 mintát kap az IEDCR-től az RT-PCR kit hatékonyságának értékelésére. A 120 mintából 60 tárolt minta lesz (30 COVID-19 ismert pozitív és 30 COVID-19 negatív minta), amelyeket -80°C-os laboratóriumi fagyasztószekrényekben tároltak az IEDCR létesítményekben, és további 60 friss minta (30 COVID-19 pozitív). és 30 COVID-19 negatív minta), amelyeket az IEDCR tesztel. Az eltérő eredményekkel rendelkező mintákat a BRiCM RT PCR készlettel történő tesztelés előtt elutasítjuk. Ez azt jelenti, hogy az IEDCR-ből több mint 120 azonosított mintára lehet szükség a BCTL/CROL által importált RT-PCR készletekkel és extrakciós készlettel történő elemzéshez. Így 120 mintát választanak ki a BRiCM RT-PCR kit teljesítményértékeléséhez.

   3.5.2 Az elfogultság és az összeférhetetlenség elkerülése érdekében a szponzort és a PI-t/társ-kutatókat nem látják a mintaazonosítók, valamint a minták pozitív/negatív státusza és a betegek klinikai feljegyzései tekintetében. Mind a tárolt, mind a friss minták pozitív/negatív állapotát az IEDCR azonosítja, mielőtt elküldené a BCTL/CROL-nak. Ez azt jelenti, hogy a BCTL/CROL személyzetet a személyazonosító okmány (ID) mintájára és a pozitív negatív/negatív státuszra is elvakítják az elemzés előtt. Végül a CRO vezetője elküldi a teljesítményértékelési tanúsítványt a PI-nek vagy a szponzornak.

   3.5.3. A mintanagyság statisztikai alapja:

   Képletek:

   A vizsgálatot 120 résztvevővel végezték (60 tárolt ismert pozitív és negatív és 60 frissen ismert pozitív és negatív). A kívánt abszolút pontosság (n) elérése érdekében az RT-PCR hatékonyságának becslésében a minimális mintaméretet a diszkrét Bernoulli valószínűségi függvény alapján becsüljük meg, az alábbiak szerint:

   Alfa= 5% D= abszolút pontosság (%) 95%-os biztonsággal. Kívánt abszolút pontosság n D Alfa=5% Z=1,96 10 30,99% n D= (1,96)/(2* négyzetgyök (SQRT) (n)) 20 21,91% 100 9,80% 30 17,89% 120 120 17,89% 120 8.0. A Az IEDCR génjeit COVID-19 pozitívnak választják ki. Azokat a mintákat, amelyek negatív RT-PCR-eredményt kaptak, és nem amplifikálták a COVID-19 géneket az IEDCR-en, COVID-19-ként választják ki.

   • Nem: Mind
   • Életkor: 5-70 év (gyermek, felnőtt, idősebb felnőtt) 7.8.2. Kizárási kritériumok
   • A szigmoid görbe és a Ct érték tekintetében kétértelmű/kétértelmű RT-PCR eredményeket mutató minták kizárásra kerülnek.

   A betegek beleegyezésére nincs szükség, mert a CRO megkapja a mintákat az IEDCR-től az IEDCR-rel kötött egyetértési megállapodás szerint. Így a CRO oldaláról nincs szükség a páciens beiratkozására, beleegyezésére és CRF-re.

   3.7 Adatgyűjtési eljárás: A COVID-19 pozitív mintákat a vírus RNS-ére vonatkozó pozitív RT-PCR eredmények laboratóriumi leletei igazolják.

   3.8 Adatelemzés: Meg kell határozni a BRiCM COVID-19 valós idejű RT-PCR készlet érzékenységét, specificitását, pozitív prediktív értékét és negatív prediktív értékét. A khi-négyzet tesztet (kétoldalas) a kategorikus változók összehasonlítására kell elvégezni. A ≤0,05 p értéket a szignifikáns asszociáció szintjének tekintjük. Az érzékenység, a specificitás, a pozitív prediktív érték és a negatív prediktív érték mellett a Kappa együttható, a pozitív valószínűségi arány és a negatív valószínűségi arány is kiszámításra kerül.

   3.9 Az adatbázist meghatározott biztonsági eljárások védik a jogosulatlan hozzáférés ellen; megfelelő biztonsági másolatot kell készíteni az adatbázisról és a kapcsolódó szoftverfájlokról. Az adatbázisokról az adatbázis-adminisztrátor biztonsági másolatot készít az adatbázis frissítéseivel vagy módosításaival együtt.

   3.10 A vizsgálónak a vizsgálati adatokat hozzáférhetővé kell tennie a monitor és a meghatalmazott képviselői számára. A vizsgálónak háromhavonta át kell adnia az adatokat tartalmazó időközi vizsgálati jelentést a fő vizsgálónak. A követelményeknek megfelelően a vizsgálati jelentés és az adatok átadhatók a Banglades Orvosi Kutatási Tanácsnak (BMRC) és a Gyógyszerigazgatási Főigazgatóságnak (DGDA). A nyomozónak gondoskodnia kell a forrásdokumentumok megbízhatóságáról és elérhetőségéről.

   3.11 A megfigyelő látogatásokat az alapvizsgáló, a társvizsgáló, valamint a képviselők végzik a helyes klinikai gyakorlatra vonatkozó irányelvek (GCP) szerint.

   3.12 A tantárgy titkosságának megőrzése érdekében csak a helyszínszám, a tárgyszám és a tárgy kezdőbetűi azonosítják az összes vizsgálati alanyt az esetnyilvántartási űrlapokon (CRF) és a vizsgálónak benyújtott egyéb dokumentumokon. A további tantárgyi titoktartási kérdéseket (ha vannak) a Klinikai tanulmányi megállapodás szabályozza.

   3.13 Minden nyilvántartást titokban kell tartani a PI, a társkutatók és a szponzor előtt, kivéve az IEDCR felelős személyeket, akik felelősek. A mintákat kód/azonosító számként és dátumként azonosítja az IEDCR, mielőtt elküldené a BCTL/Contact Research Organization Limited (CROL) részére 4. Ehhez a vizsgálathoz az említett intézet IEDCR/Bangladesh Clinical Trail Limited (BTCL)/CRO Ltd. képes végezzék el a klinikai vizsgálatot, hogy megtudják a készlet hatékonyságát a meglévő erőforrásaik révén. Emellett a CRO kezelheti a vegyszert, a reagenst és a technológiát, ha szükséges a tanulmányhoz, a finanszírozó ügynökségek közötti egyetértési megállapodás szerint.

   5. Összeférhetetlenség A BRiCM a javasolt COVID-19 RT-PCR készlet finanszírozója, a Tudományos és Technológiai Minisztérium adminisztratív felügyelete alatt működő törvényes testület. Kutatószervezet és referenciaintézet a kémiai mérések területén. Ez sem nem kereskedelmi vállalkozás, sem nem profitorientált szervezet. Az alkotmányos szankció szerint a BRiCM fő felelőssége, hogy olyan innovációhoz vezető kutatásokat folytasson, amelyek hozzáadott értéket képviselnek az emberek jólétét biztosító kormányzati erőfeszítésekhez.