オリーブの葉由来のオレウロペインが豊富なサプリメントの投与による歯周病の高齢患者の補助治療 (OLIVAGING)

サンプルサイズを計算するには、GRANMO ツール (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) 0.05 のアルファ リスク、両側性コントラスト、0.20 のベータ リスク、2.5 の差の標準偏差、ベースラインと研究の終わりの間で検出されるプロービング深度の 1 mm の減少の最小差を考慮して、使用されています。 20% の追跡損失の予測割合。

治療 すべての患者は、ベースライン時および治療後4か月後に完全な口腔検査を受けます。 初期治療はすべての患者に実施され、必要に応じて手動で、および超音波器具を使用して、口全体のスケーリングと根の計画を行います。 この治療は、口腔衛生の指示で完了します。 すべての初期治療手順は、同じ歯周病専門医によって行われます。

歯周治療後、登録されたボランティアは、2 番目の歯周病専門医によって 2 つのグループのいずれかにランダムに割り当てられます。 対照グループには、プラセボ (賦形剤のみ) を含むハード ゼラチン カプセルが与えられますが、実験グループには、同じハード ゼラチン カプセルが与えられますが、200 mg のオリーブ葉抽出物が含まれます。 ランダム化は、最初の科目の登録時に行われる乱数チャート (コイントス) を使用して行われ、次の科目は最初の科目の割り当てに基づいて他のグループに割り当てられます。 プラセボとカプセルの両方が同じ人によって分配され、被験者にはその使用に関する口頭および書面による指示が与えられます. ボランティアが登録されると、一連の試験番号が割り当てられ、1 か月分のカプセルが提供されます。 被験者は、カプセルを補充するために、試験の過程で4週間ごとに学部に来ます。 カプセルの摂取は合計4ヶ月続きます。 残りの薬はコンプライアンスのためにチェックされます。 カプセルは、グラナダの Technological Health Park にある CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) で製造されます。 オリーブ抽出物は、Natac 社 (マドリッド、スペイン) から入手します。

サンプルの収集と分析 すべてのデータ収集と決定は、ベースライン時と 4 か月後に実行されます。

A) 口腔検査 歯周の臨床測定には、歯肉縁上の歯垢およびプロービング時の歯肉出血 (BOP) の有無、ならびに歯周プロービング深度 (PPD) および歯肉縁の後退 (GM) が含まれます。 パラメーターは、校正済みの歯周プローブ (Hu-Friedy®、シカゴ、イリノイ州、米国)、長さ 15 mm、0.35 mm を使用して、すべての歯の 6 つの部位 (近心頬側、頬側、遠心頬側、両舌側、舌側、および近舌側) で測定されます。直径mm。 臨床愛着度（CAL）は、PDDに景気後退を加えることで計算されます。 残っている歯の数も記録されます。 O´Leary のプラーク指数、Van der Velden の出血指数も計算されます。 BOP部位が10%未満、PPDが3mm以下、紅斑および浮腫がない患者は、歯周病の健康な被験者とみなされます。

B) 社会人口学的データ収集

1. 基本的な社会人口統計データ: 年齢、性別、教育年数が含まれます。
2. 財務状況: 参加者は、過去 3 年間の平均収入を 4 段階で報告するよう求められます (低、日々の出費を賄うのに不十分 = 1、中、日々の出費を賄うのに苦労している = 2、良い、十分に賄うことができる) 1 日の費用 = 3、非常に良い、1 日の費用を賄うのに非常に適切 = 4)。
3. 喫煙状況: 現在の喫煙者は、インタビューの時点で喫煙者と定義されます。 元喫煙者とは、以前に喫煙していたが、1 年以上吸っていなかった人と定義されます。 残りの参加者は、一時的または非現在の喫煙者として定義されます。
4. 身体活動レベル: 自己申告の国際身体活動アンケート (IPAQ) を使用して、1 週間あたりの代謝当量 (MET) 分で評価されます。 1 週間に少なくとも 3 MET 分を報告した人は、身体的にアクティブ (最小アクティブ - または「健康増進身体活動 (HEPA) アクティブ」) として分類されます。 他のすべては、身体的に不活発であると定義されます。 さらに、身体活動の毎週の頻度が記録されます。
5. 先月のうつ病の症状: 検証済みの短縮された自己報告の老年うつ病尺度 (GDS) (範囲 0-20) を使用して評価されます。 0 から 4 の間の GDS スコアは、うつ病がないことを示すために使用されますが、5-10 および N 10 のスコアは、それぞれ軽度および重度のうつ病を示します。
6. ヘルスケアの使用: 居住地域における私立医院、公立または私立のヘルスケアセンターまたは病院の存在、および健康状態の定期検査のための年間訪問回数が記録されます。
7. 成人の社会参加：この目的のために、家族、友人との社会活動の週ごとの頻度、および遠足の年ごとの頻度が記録されます。

C) 人体測定特性と血圧

1. 体重、身長、胴囲を計測いたします。 BMIとウエストヒップ比が計算されます。 過体重は BMI が 25.0 から 29.9 kg/m2 の間であると定義され、肥満は BMI >29.9 kg/m2 であると定義されます。
2. 血圧: 血圧レベルが 140/90 mmHg を超える患者、または降圧薬を使用している患者は、高血圧に分類されます。

D) 食生活の評価 食生活の評価は、半定量的食物頻度質問票 (FFQ) に基づいて行われます。 FFQ を使用して地中海食への順守レベルを評価し、MedDietScore (理論範囲 0 ～ 55) を使用しました。

E) 採血および分析 血液サンプル (16 mL) は、座位でうっ滞することなく、12 時間一晩絶食させた後、前腕の静脈穿刺によって収集されます。 全血サンプルは、血液学的評価に使用されます。 血液の大部分を EDTA 含有チューブ (1 mg/ml) に採取し、血漿を 1000 xg で 10 分間遠心分離して分離し、250 μl のアリコートに分割して、即時分析または -80 °C での保存を行います。 . 血液は、他の追加分析のために単離された血液単核細胞 (BMC) を取得するためにも使用されます。 血漿または BMC の両方を含むアリコートは、分析まで -80º C で保存されます。

血液分析は次のようになります。

1. 生化学的評価：空腹時血中脂質レベル（高密度リポタンパク質コレステロール（HDL）、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL）、直接LDLコレステロール、超低密度コレステロール（VLDL）およびトリグリセリド（TG）を含む）、血漿グルコース、高感度のC反応性タンパク質、LPa、コルチゾール、フィブリノーゲン、およびホモシステインのレベルは、自動分析装置を使用して血漿で決定されます。 空腹時血糖値が 126 mg/dL を超える患者、抗糖尿病薬を使用している患者、または以前に糖尿病と診断された患者は、米国糖尿病協会の診断基準に従って 2 型糖尿病と判定されます。 高コレステロール血症は、National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III ガイドラインによると、総血清コレステロール値が 200 mg/dL を超えるか、脂質低下薬を使用していると定義されます。
2. 血液学的研究: 全血サンプルのヘモグラムおよび血球プロファイル。
3. 循環炎症性マーカー：IL-1βおよびIL-18を含む複数の炎症性サイトカインの循環レベルは、市販のマルチプレックスキット（Cytokine Panel 1B 25plex、Thermo Fisher Scientific）によって分析されます。 さらに、活性型カスパーゼ 1 のタンパク質レベルと Nlrp3 (CIAS1) およびカスパーゼ 1 の遺伝子発現は、それぞれウェスタンブロッティングおよび RT-PCR によって単離された PBMC で決定され、インフラマソーム活性を評価します。
4. オートファジー マーカー: MAP-LC3、ATG12、p62、TFEB、Beclin-1、および B および D カテプシンのレベルは、分離された PBMC タンパク質分離株でウエスタンブロット法によって決定されます。 Beclin-1, y Maplc3 遺伝子発現は、ベータアクチンをハウスキーパー遺伝子として使用して、単離された PBMC で RT-PCR によって決定されます。
5. 酸化ストレスマーカーと抗酸化能: 脂質への損傷は尿中の 15-F2 イソプロスタンの測定により分析され、タンパク質への損傷は血漿中のカルボニルタンパク質の測定により分析され68、DNA への損傷は尿中の 8-ヒドロキシグアノシン (8OHdG) の測定により分析されます。 . さらに、in situ酸化還元状態の決定は、指からの血液滴を使用して、診療所で被験者で実行されます。 これは、サンプルの抗酸化能も測定する Redoxsys システム (Aytu BioScience, Inc.、Englewood、USA) を介して実行されます。 これは、生物学的サンプルの総酸化還元電荷とそれらの抗酸化能力が利用可能になる前に信頼性を持って測定する新しいシステムです。
6. メタボロミクス研究: この分析を実行するために、さまざまなサンプルの代謝産物が最初に抽出されます。 次に、メタノール抽出物中に存在する分子をクロマトグラフィーで分離します。 溶出液は、ESI-Q-TOF-MS / MS システムでエレクトロスプレーによってモニターされます98。 結果の分析は、リェイダ大学の Reinald Pamplona 博士と協力して実施されます。博士とは、この問題について長年協力しており、メタボロミクスに関する一連の研究と出版物を共有しています。

F) 歯周微生物叢の研究。 歯肉縁下プラーク サンプルは、ゾーンを分離した後 30 s の間に歯周ポケットにろ紙の先端を置くことによって、PPD が最も高い 3 つの部位から収集されます。

乾いた紙に集められた歯肉縁下のプラークサンプルは、既知の歯周病原体の存在を評価するために PCR によって分析されます。 微生物叢の研究は、16S rDNA 質量配列決定技術を使用して実施されます。 配列決定とバイオインフォマティクス分析は、カナダのダルハウジー大学の Integrated Microbiome Resource によって実施されます。

G) 尿中の測定。

空腹時尿を採取し、以下の測定を行います。

1. 酸化的損傷マーカー：8-ヒドロキシ-2-デオキシグアノシンおよび総F2-イソプロスタンは、競合酵素イムノアッセイによって尿で測定されます。 結果は尿中クレアチニンに対して正規化されます。
2. オレウロペイン代謝物濃度: 以前の研究と同様に、LC-ESI-MS/MS によって定量化されます。

H) 成功した老化指数計算 成功した老化指数 (SAI) は、0 から 10 までの範囲の潜在的なスコアで、研究参加者の老化を評価するために採用されます。 完全な指標には、教育、財政状況、身体活動、BMI、GDS スコア、友人との社会活動への参加、家族との社会活動への参加、年次遠足、CVD 危険因子スコア、および指標を作成するための地中海式食事順守レベルが含まれます。 古典的な心血管疾患の危険因子（すなわち、肥満および高血圧、糖尿病、高コレステロール血症の病歴）の全体的な負担を示す累積変数（範囲0〜4）が開発されます（前述の危険因子のいずれも持たない参加者はスコア0を受け取り、 1 つの因子スコア 1 など)。

I) 介入の成功基準 オレウロペインによる介入の成功を評価するために、プロービング深度 (PD) の 1 mm 以上の減少が主な変数と見なされます。 さらに、二次的な成功基準として、アタッチメント レベルが 1 mm 以上減少すること、およびプロービング時の歯肉出血が 20% 以上減少することが求められます。

J) 統計分析 研究された主な変数の記述的分析が行われます。 通常の量的変数の場合、平均と標準偏差が計算されます。非正規性の場合は、中央値とパーセンタイルが計算されます。 定性的変数は、絶対度数と相対度数を使用して表現されます。 変数の正規性は、比較研究を実行する前に変換 (対数など) を実行する必要があるかどうかを判断するために、コルモゴロフ-スミルノフ検定でチェックされます。 同じグループのさまざまな変数に対する治療の効果を調べるために、関連するサンプルのスチューデントの t 検定が使用されます。 両方の実験グループ間で同じ実験時間に比較分析を行うために、独立したサンプルのスチューデントの t 検定が使用されます。