Adjuvanttihoito iäkkäillä parodontiittipotilailla antamalla runsaasti oliivinlehdestä peräisin olevaa oleuropeiinia (OLIVAGING)

Otoskoon laskemiseksi GRANMO-työkalu (https://www.imim.es/ofertaserveis/software-public/granmo/) on käytetty, ottaen huomioon alfariskin 0,05, kahdenvälisen kontrastin, beetariskin 0,20, erojen keskihajonnan 2,5, vähimmäiseron, joka on 1 mm:n vähennys koetussyvyydessä, joka on havaittava lähtötilanteen ja tutkimuksen lopun välillä, ja ennustettu osuus menetyksen 20 % seurannasta.

Hoidot Kaikki potilaat saavat täydellisen suun tutkimuksen lähtötilanteessa ja 4 kuukauden kuluttua hoidon jälkeen. Alkuhoito suoritetaan kaikille potilaille, ja se koostuu koko suun hilseilystä ja juurisuunnittelusta käsin ja tarvittaessa ultraääniinstrumenteilla. Tämä hoito suoritetaan suuhygieniaohjeilla. Kaikki alkuhoitotoimenpiteet suorittaa sama parodontologi.

Parodontaalihoidon jälkeen toinen parodontologi jakaa vapaaehtoiset satunnaisesti toiseen kahdesta ryhmästä. Kontrolliryhmä saa kovia gelatiinikapseleita, jotka sisältävät lumelääkettä (vain apuaineet), kun taas koeryhmä saa samat kovat liivatekapselit, jotka sisältävät 200 mg oliivinlehtiuutetta. Satunnaistaminen tehdään käyttämällä satunnaislukukaavioita (kolikonheitolla), joka suoritetaan ensimmäisen koehenkilön ilmoittautumisen yhteydessä, ja seuraava kohde jaetaan toiseen ryhmään ensimmäisen koehenkilön toimeksiannon perusteella. Sekä lumelääkettä että kapseleita jakaa sama henkilö, ja koehenkilöille annetaan suulliset ja kirjalliset ohjeet sen käytöstä. Kun vapaaehtoisia otetaan mukaan, heille jaetaan peräkkäiset tutkimusnumerot ja kapselit, jotka riittävät yhdeksi kuukaudeksi. Koehenkilöt tulevat tiedekuntaan 4 viikon välein kokeen aikana täydentämään kapseleitaan. Kapseleiden nauttiminen kestää yhteensä 4 kuukautta. Jäljellä olevien lääkkeiden yhteensopivuus tarkistetaan. Kapselit valmistetaan CIDAFissa (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) Technological Health Parkissa Granadassa. Oliiviuute hankitaan Natac-yhtiöltä (Madrid, España).

Näytteenotto ja analyysit Kaikki tiedonkeruu ja määritykset suoritetaan lähtötilanteessa ja 4 kuukauden kuluttua.

A) Suun tutkimukset Parodontaaliset kliiniset mittaukset sisältävät supragingivaalisen hammasplakin ja ienverenvuodon esiintymisen tai puuttumisen koetuksella (BOP), periodontaalisen mittaussyvyyden (PPD) ja ienreunan taantuman (GM). Parametrit mitataan kuudesta kohdasta (mesiobukkaalinen, bukkaalinen, distobukkaalinen, distolinguaalinen, linguaalinen ja mesiolinguaalinen) jokaisesta hampaasta kalibroidulla periodontaalisella anturin (Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA), 15 mm pitkä ja 0,35 mm. mm halkaisijaltaan. Kliininen kiinnitystaso (CAL) lasketaan lisäämällä taantuma PDD:hen. Myös jäljellä olevien hampaiden määrä kirjataan. Myös O´Learyn plakkiindeksi, Van der Veldenin verenvuotoindeksi lasketaan. Potilaat, joiden BOP-kohta <10 %, PPD ≤3 mm, punoitus ja turvotus puuttuvat, katsotaan terveiksi henkilöiksi.

B) Sosiodemografisen tiedon kerääminen

1. Sosiodemografiset perustiedot: nämä sisältävät iän, sukupuolen ja koulutusvuodet.
2. Taloudellinen tilanne: osallistujia pyydetään raportoimaan keskitulonsa kolmen edellisen vuoden ajalta nelipisteasteikolla (matala, riittämätön kattamaan päivittäisiä kuluja = 1, keskitaso, yrittää kattaa päivittäiset kulut = 2, hyvä, riittävä kattamaan päiväkulut = 3, erittäin hyvä, erittäin riittävä kattamaan päivittäiset kulut = 4).
3. Tupakointitila: nykyiset tupakoitsijat määritellään tupakoijiksi haastatteluhetkellä. Entiset tupakoitsijat määritellään henkilöiksi, jotka ovat aiemmin tupakoineet, mutta eivät olleet tupakoineet vuoteen tai pidempään. Loput osallistujat määritellään satunnaisiksi tai ei-toivotuiksi tupakoiviksi.
4. Fyysisen aktiivisuuden taso: se arvioidaan metabolisen ekvivalentin (MET) minuutteina viikossa käyttämällä itse ilmoittamaa kansainvälistä fyysinen aktiivisuuskyselyä (IPAQ). Ne, jotka raportoivat vähintään 3 MET-minuuttia viikossa, luokitellaan fyysisesti aktiivisiksi (minimiaktiivisiksi - tai "terveyttä edistäviksi fyysisesti aktiivisiksi (HEPA)"). Kaikki muut määritellään fyysisesti passiivisiksi. Lisäksi kirjataan viikoittainen fyysinen aktiivisuus.
5. Viime kuun masennuksen oireet: ne arvioidaan validoidulla lyhennetyllä itseraportoidulla Geriatric Depression Scale (GDS) -asteikolla (alue 0-20). GDS-pisteitä 0–4 käytetään osoittamaan, ettei masennusta ole, kun taas pisteet 5–10 ja N 10 osoittavat vastaavasti lievää ja vakavaa masennusta.
6. Terveydenhuollon käyttö: yksityisten lääkärien vastaanoton, julkisten tai yksityisten terveyskeskusten tai sairaaloiden läsnäolo asuinalueella sekä vuosittainen säännöllinen terveydentilan tarkastuskäyntien määrä kirjataan.
7. Aikuisten sosiaalinen osallistuminen: tätä tarkoitusta varten kirjataan heidän sosiaalisten aktiviteettiensa viikoittainen taajuus perheen, ystävien kanssa sekä vuosittainen retkien tiheys.

C) Antropometriset ominaisuudet ja verenpaine

1. Paino, pituus ja vyötärön ympärysmitta mitataan. BMI ja vyötärön ja lantion välinen suhde lasketaan. Ylipaino määritellään BMI:ksi välillä 25,0-29,9 kg/m2, kun taas lihavuudesta määritellään BMI > 29,9 kg/m2.
2. Verenpaine: potilaat, joiden verenpaine on > 140/90 mmHg tai jotka käyttävät verenpainelääkkeitä, luokitellaan hypertensiivisiksi.

D) Ruokailutottumusten arviointi Ruokailutottumusten arviointi perustuu puolikvantitatiiviseen ruokatiheyskyselyyn (FFQ). FFQ:ta käytetään Välimeren ruokavalion noudattamisen tason arvioimiseen. Käytettiin MedDietScorea (teoreettinen alue 0-55).

E) Verinäytteiden otto ja analyysi Verinäytteet (16 ml) otetaan kyynärvarren laskimopunktiolla 12 tunnin yön yli paaston jälkeen ilman pysähtymistä istuma-asennossa. Hematologisissa arvioinneissa käytetään kokoverinäytteitä. Suurin osa verestä otetaan EDTA:ta sisältäviin putkiin (1 mg/ml) ja plasma eristetään sentrifugoimalla 1000 xg:llä 10 minuutin ajan ja jaetaan 250 μl:n eriin välitöntä analyysiä tai -80 °C:ssa säilytystä varten. . Verta käytetään myös eristettyjen veren mononukleaaristen solujen (BMC) saamiseksi muita lisäanalyysejä varten. Molempia, plasmaa tai BMC:itä sisältävät alikvootit säilytetään -80 ºC:ssa analyyseihin asti.

Verianalyysit ovat seuraavat:

1. Biokemialliset arvioinnit: paastoveren lipiditasot (mukaan lukien korkeatiheyksinen lipoproteiinikolesteroli (HDL), matalatiheyksinen lipoproteiinikolesteroli (LDL), suora LDL-kolesteroli, erittäin matalatiheyksinen kolesteroli (VLDL) ja triglyseridit (TG), plasman glukoosi , erittäin herkän C-reaktiivisen proteiinin, LPa:n, kortisolin, fibrinogeenin ja homokysteiinin tasot määritetään plasmasta automaattisen analysaattorin avulla. Potilaat, joiden paastoverensokeri on > 126 mg/dl, käyttävät diabeteslääkitystä tai joilla on aiemmin diagnosoitu diabetes, määritetään tyypin 2 diabetekseksi American Diabetes Associationin diagnostisten kriteerien mukaisesti. Hyperkolesterolemia määritellään seerumin kokonaiskolesterolitasoksi >200 mg/dl tai lipidejä alentavien aineiden käytöksi kansallisen kolesterolikasvatusohjelman aikuisten hoitopaneelin III ohjeiden mukaisesti.
2. Hematologinen tutkimus: hemogrammi ja verisoluprofiili kokoverinäytteissä.
3. Verenkierrossa olevat proinflammatoriset markkerit: useiden tulehduksellisten sytokiinien, mukaan lukien IL-1β ja IL-18, verenkierrossa olevat tasot analysoidaan kaupallisella multipleksipakkauksella (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Lisäksi aktiivisen kaspaasi-1:n proteiinitasot ja Nlrp3:n (CIAS1) ja kaspaasi-1:n geeniekspressio määritetään eristetyissä PBMC:issä Western-blottauksella ja RT-PCR:llä, vastaavasti, tulehduksellisen aktiivisuuden arvioimiseksi.
4. Autofagiamarkkerit: MAP-LC3-, ATG12-, p62-, TFEB-, Beclin-1- ja B- ja D-katepsiinien tasot määritetään Western-blottauksella eristetyistä PBMC-proteiini-isolaateista. Beclin-1, y Maplc3-geeniekspressiot määritetään RT-PCR:llä eristetyissä PBMC:issä käyttämällä beeta-aktiinia taloudenhoitajageeninä.
5. Oksidatiiviset stressimarkkerit ja antioksidanttikapasiteetti: lipidien vauriot analysoidaan määrittämällä virtsasta 15-F2-isoprostaaneja, vaurioita proteiineille määrittämällä plasman karbonyyliproteiineja68 ja vaurioita DNA:lle määrittämällä virtsasta 8-hydroksiguanosiini (8OHdG) . Lisäksi in situ -pelkistystilan määritys tehdään klinikalla koehenkilöillä sormesta tulevalla veripisaralla. Se suoritetaan Redoxsys-järjestelmän (Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA) kautta, joka mittaa myös näytteen antioksidanttikapasiteettia. Tämä on uusi järjestelmä, joka mittaa luotettavasti ennen kuin ei ole saatavilla biologisten näytteiden kokonaispelkistysvarausta sekä niiden antioksidanttikapasiteettia.
6. Aineenvaihduntatutkimus: näiden analyysien suorittamiseksi eri näytteiden metaboliitit uutetaan ensin. Sitten metanoliuutteessa olevat molekyylit erotetaan kromatografialla. Eluaattia tarkkaillaan ESI-Q-TOF-MS/MS-järjestelmässä sähkösumutuksella98. Tulosten analysointi toteutetaan yhteistyössä Lleidan yliopiston tohtori Reinald Pamplonan kanssa, jonka kanssa olemme tehneet yhteistyötä tämän asian parissa jo vuosia ja jonka kanssa jaamme metabolomiikkaa koskevia tutkimuksia ja julkaisuja.

F) Parodontaalisen mikrobiston tutkimus. Subgingivaaliset plakkinäytteet kerätään kolmesta kohdasta, joilla on korkeimmat PPD-arvot, laittamalla parodontaalitaskuun suodatinpaperin kärki 30 sekunnin ajaksi vyöhykkeen eristämisen jälkeen.

Kuiviin papereihin kerätyt subgingivaaliset plakkinäytteet analysoidaan PCR:llä tunnettujen peridontopatogeenien: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, esiintymisen arvioimiseksi. Mikrobioottitutkimukset suoritetaan käyttämällä 16S rDNA:n massasekvensointitekniikoita. Sekvensoinnin ja bioinformaattisen analyysin suorittaa Integrated Microbiome Resource, Dalhousien yliopistosta Kanadasta.

G) Määritykset virtsasta.

Paastovirtsa kerätään ja tehdään seuraavat määritykset:

1. Oksidatiiviset vauriomerkit: 8-hydroksi-2-deoksiguanosiini ja F2-isoprostaanien kokonaismäärä mitataan virtsasta kilpailevalla entsyymi-immunomäärityksellä. Tulokset normalisoidaan virtsan kreatiniiniksi.
2. Oleuropeiinin metaboliittien pitoisuus: ne kvantifioidaan LC-ESI-MS/MS:llä kuten aikaisemmissa tutkimuksissa.

H) Onnistuneen ikääntymisen indeksilaskenta Tutkimukseen osallistuneiden ikääntymisen arvioinnissa käytetään onnistuneen ikääntymisen indeksiä (SAI), jonka mahdolliset pisteet vaihtelevat 0–10. Täysi indeksi kattaa koulutuksen, taloudellisen tilan, fyysisen aktiivisuuden, BMI:n, GDS-pisteet, osallistumisen sosiaalisiin aktiviteetteihin ystävien kanssa, perheen kanssa, vuosittaiset retket, sydän- ja verisuonitautien riskitekijöiden pisteet ja Välimeren ruokavalion noudattamisen tason indeksin kehittämiseksi. Kehitetään kumulatiivinen muuttuja (alue 0-4), joka ilmaisee klassisten sydän- ja verisuonitautien riskitekijöiden (eli liikalihavuuden ja aiempi verenpainetauti, diabetes ja hyperkolesterolemia) kokonaistaakan (osallistujat, joilla ei ole mitään edellä mainituista riskitekijöistä, saavat arvosanan 0, jos heillä on yksi tekijä pisteet 1 jne.).

I) Intervention onnistumiskriteerit Oleuropeiinilla suoritetun toimenpiteen onnistumisen arvioimiseksi päämuuttujaksi otetaan 1 mm:n tai enemmän mittaussyvyyden (PD) pieneneminen. Lisäksi toissijaisina onnistumiskriteereinä otetaan kiinnitystason aleneminen vähintään 1 mm:llä sekä ienverenvuodon väheneminen yli 20 % koettaessa.

J) Tilastollinen analyysi Tutkituista päämuuttujista tehdään kuvaava analyysi. Normaaleille kvantitatiivisille muuttujille lasketaan keskiarvo ja keskihajonta tai mediaani ja prosenttipisteet, jos kyseessä on ei-normaali. Laadulliset muuttujat ilmaistaan ​​käyttämällä absoluuttisia ja suhteellisia taajuuksia. Muuttujien normaalisuus tarkistetaan Kolmogorov-Smirnov-testillä, jotta voidaan määrittää tarve suorittaa muunnoksia (logaritmia ja muita) ennen vertailututkimusten suorittamista. Hoidon vaikutuksen tutkimiseen saman ryhmän eri muuttujiin käytetään Studentin t-testiä toisiinsa liittyville näytteille. Vertailevien analyysien suorittamiseksi samanaikaisesti molempien koeryhmien välillä käytetään Studentin t-testiä riippumattomille näytteille.