Адъювантное лечение пожилых пациентов с пародонтитом путем введения добавки, богатой олеуропеином, из листьев оливы (OLIVAGING)

Для расчета размера выборки используется инструмент GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/). был использован, учитывая альфа-риск 0,05, двустороннее контрастирование, бета-риск 0,20, стандартное отклонение различий 2,5, минимальную разницу в 1 мм уменьшения глубины зондирования, которая должна быть обнаружена между исходным уровнем и концом исследования, и прогнозируемая доля потерь 20% отслеживания.

Лечение Все пациенты проходят полное обследование полости рта в начале лечения и через 4 месяца после лечения. Начальная терапия будет проводиться у всех пациентов и будет состоять из полного удаления зубного камня и планирования корней вручную и при необходимости с помощью ультразвуковых инструментов. Это лечение будет завершено инструкциями по гигиене полости рта. Все начальные терапевтические процедуры будут выполняться одним и тем же пародонтологом.

После пародонтологического лечения зачисленные добровольцы будут случайным образом распределены в одну из двух групп вторым пародонтологом. Контрольная группа получит твердые желатиновые капсулы, содержащие плацебо (только вспомогательные вещества), тогда как экспериментальная группа получит такие же твердые желатиновые капсулы, но содержащие 200 мг экстракта листьев оливы. Рандомизация будет осуществляться с использованием таблиц случайных чисел (методом подбрасывания монеты), которые будут выполняться во время регистрации первого субъекта, а следующий субъект будет отнесен к другой группе на основе назначения первого субъекта. И плацебо, и капсулы будут выдаваться одним и тем же человеком, и субъектам будут даны устные и письменные инструкции по его использованию. По мере набора добровольцев им будут присвоены последовательные номера исследований и предоставлены их капсулы, которых хватит на один месяц. Субъекты будут приходить на факультет каждые 4 недели в течение испытания, чтобы пополнить свои капсулы. Прием капсул рассчитан на 4 месяца. Остальные лекарства будут проверены на соответствие. Капсулы будут готовиться в CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) в Технологическом парке здоровья в Гранаде. Экстракт оливок будет получен от компании Natac (Мадрид, Испания).

Сбор проб и анализ Все сборы данных и определения будут выполняться на исходном уровне и через 4 месяца.

A) Осмотр полости рта. Клинические измерения пародонта будут включать наличие или отсутствие наддесневого зубного налета и кровоточивости десен при зондировании (BOP), а также глубину зондирования пародонта (PPD) и рецессию края десны (GM). Параметры будут измеряться в шести местах (мезиощечном, щечном, дистально-щечном, дистолингвальном, лингвальном и мезиолингвальном) на каждом зубе с помощью калиброванного пародонтального зонда (Hu-Friedy®, Чикаго, Иллинойс, США), длиной 15 мм и диаметром 0,35 мм. мм в диаметре. Уровень клинической привязанности (CAL) будет рассчитан путем добавления рецессии к PDD. Количество оставшихся зубов также будет записано. Также будут рассчитаны индекс налета О'Лири, индекс кровотечения Ван дер Фельдена. Пациенты с сайтом BOP <10%, PPD ≤3 мм, отсутствием эритемы и отека будут считаться субъектами со здоровым пародонтом.

Б) Сбор социально-демографических данных

1. Основные социально-демографические данные: к ним относятся возраст, пол, количество лет обучения.
2. Финансовое положение: участников попросят указать свой средний доход за предыдущие три года по четырехбалльной шкале (низкий, недостаточный для покрытия ежедневных расходов = 1, средний, изо всех сил пытается покрыть ежедневные расходы = 2, хороший, достаточный для покрытия ежедневных расходов). ежедневные расходы = 3, очень хорошо, вполне достаточно для покрытия ежедневных расходов = 4).
3. Статус курения: нынешние курильщики будут определены как курильщики на момент опроса. Бывшие курильщики будут определяться как те, кто ранее курил, но не делал этого в течение года или более. Остальные участники будут определены как случайные или не курящие в настоящее время.
4. Уровень физической активности: он будет оцениваться в метаболическом эквиваленте (МЭТ) в минутах в неделю с использованием Международного опросника физической активности (IPAQ). Те, кто сообщил о не менее 3 MET-минутах в неделю, будут классифицированы как физически активные (минимально активные - или «физическая активность, улучшающая здоровье (HEPA) активная»). Все остальные будут определены как физически неактивные. Кроме того, еженедельная частота физической активности будет записываться.
5. Симптомы депрессии за последний месяц: они будут оцениваться с использованием утвержденной укороченной шкалы гериатрической депрессии (GDS) (диапазон 0-20). Оценка по шкале GDS от 0 до 4 будет использоваться для обозначения отсутствия депрессии, тогда как оценки от 5 до 10 и N 10 будут указывать на легкую и тяжелую депрессию соответственно.
6. Использование в здравоохранении: будет регистрироваться наличие кабинетов частных врачей, государственных или частных медицинских центров или больниц в районе проживания, а также ежегодное количество посещений для регулярной проверки состояния здоровья.
7. Социальное участие взрослых: для этой цели будет регистрироваться еженедельная частота их социальных мероприятий с семьей, друзьями, а также их годовая частота экскурсий.

В) Антропометрические характеристики и артериальное давление

1. Будут измеряться вес, рост и окружность талии. Будет рассчитан ИМТ и соотношение талии и бедер. Избыточный вес определяется как ИМТ от 25,0 до 29,9 кг/м2, а ожирение определяется как ИМТ >29,9 кг/м2.
2. Артериальное давление: пациенты с уровнем артериального давления> 140/90 мм рт. ст. или принимающие антигипертензивные препараты будут классифицированы как гипертоники.

D) Оценка пищевых привычек Оценка пищевых привычек будет основываться на полуколичественном вопроснике частоты пищевых продуктов (FFQ). Для оценки уровня приверженности средиземноморской диете будет использоваться FFQ, использовалась шкала MedDietScore (теоретический диапазон 0-55).

E) Забор крови и анализ Образцы крови (16 мл) будут собираться путем венепункции предплечья после 12-часового ночного голодания без стаза в сидячем положении. Образцы цельной крови будут использоваться для гематологических оценок. Большую часть крови отбирают в пробирки с ЭДТА (1 мг/мл), а плазму выделяют центрифугированием при 1000 x g в течение 10 мин и делят на аликвоты по 250 мкл для немедленного анализа или для хранения при -80 °C. . Кровь также будет использоваться для получения изолированных мононуклеарных клеток крови (BMC) для других дополнительных анализов. Аликвоты, содержащие как плазму, так и BMC, будут храниться при температуре -80ºC до проведения анализов.

Анализы крови будут следующие:

1. Биохимические оценки: уровни липидов в крови натощак (включая холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), прямой холестерин ЛПНП, холестерин очень низкой плотности (ЛПОНП) и триглицериды (ТГ), глюкоза плазмы) , высокочувствительный С-реактивный белок, LPa, уровни кортизола, фибриногена и гомоцистеина будут определяться в плазме с помощью автоматического анализатора. Пациенты, у которых уровень глюкозы в крови натощак > 126 мг/дл, принимающие антидиабетические препараты или с предшествующим диагнозом диабета, будут определяться как сахарный диабет 2 типа в соответствии с диагностическими критериями Американской диабетической ассоциации. Гиперхолестеринемия будет определяться как уровень общего холестерина в сыворотке >200 мг/дл или использование препаратов, снижающих уровень липидов, в соответствии с рекомендациями Национальной образовательной программы по лечению холестерина у взрослых.
2. Гематологическое исследование: гемограмма и профиль клеток крови в образцах цельной крови.
3. Циркулирующие провоспалительные маркеры: циркулирующие уровни множества воспалительных цитокинов, включая IL-1β и IL-18, будут проанализированы с помощью коммерческого мультиплексного набора (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Кроме того, уровни белка активной каспазы-1 и экспрессия генов Nlrp3 (CIAS1) и каспазы-1 будут определяться в изолированных РВМС с помощью вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР, соответственно, для оценки активности воспаления.
4. Маркеры аутофагии: MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 и уровни катепсинов B и D будут определяться вестерн-блоттингом в выделенных белковых изолятах РВМС. Экспрессию генов Beclin-1, y Maplc3 будут определять с помощью ОТ-ПЦР в изолированных РВМС с использованием бета-актина в качестве гена домашнего хозяйства.
5. Маркеры окислительного стресса и антиоксидантная способность: повреждение липидов будет анализироваться путем определения в моче 15-F2 изопростана, повреждение белков путем определения карбонильных белков в плазме68 и повреждение ДНК посредством определения в моче 8-гидроксигуанозина (8OHdG). . Кроме того, определение окислительно-восстановительного состояния in situ будет проводиться у субъектов в клинике с использованием капли крови из пальца. Он будет проводиться через систему Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Энглвуд, США), которая также измеряет антиоксидантную способность образца. Это новая система, которая надежно измеряет общий окислительно-восстановительный заряд в биологических образцах, а также их антиоксидантную способность.
6. Метаболическое исследование: для проведения этого анализа сначала экстрагируются метаболиты различных образцов. Затем молекулы, присутствующие в метанольном экстракте, разделяют с помощью хроматографии. Элюат контролируют в системе ESI-Q-TOF-MS/MS с помощью электрораспыления98. Анализ результатов будет проводиться в сотрудничестве с доктором Рейнальдом Памплоной из Университета Лериды, с которым мы много лет сотрудничаем по этому вопросу и с которым у нас есть ряд исследований и публикаций по метаболомике.

F) Исследование микробиоты пародонта. Образцы поддесневого зубного налета будут взяты из трех участков с самыми высокими PPD путем помещения в пародонтальный карман кончика фильтровальной бумаги в течение 30 с после выделения зоны.

Образцы поддесневого зубного налета, собранные на сухой бумаге, будут проанализированы с помощью ПЦР для оценки присутствия известных перидонтопатогенов: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Исследования микробиоты будут проводиться с использованием методов массового секвенирования 16S рДНК. Секвенирование и биоинформационный анализ будет выполнять Интегрированный ресурс микробиома Университета Далхаузи в Канаде.

Ж) Определения в моче.

Будет собрана моча натощак и будут выполнены следующие определения:

1. Маркеры окислительного повреждения: 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин и общее количество F2-изопростанов будут измеряться в моче с помощью конкурентного иммуноферментного анализа. Результаты будут нормализованы по креатинину в моче.
2. Концентрация метаболитов олеуропеина: они будут количественно определены с помощью LC-ESI-MS/MS, как и в предыдущих исследованиях.

H) Расчет индекса успешного старения Индекс успешного старения (SAI) с потенциальными баллами в диапазоне от 0 до 10 будет использоваться для оценки старения участников исследования. Полный индекс включает в себя образование, финансовое положение, физическую активность, ИМТ, балл GDS, участие в социальных мероприятиях с друзьями, семьей, ежегодные экскурсии, балл факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний и уровень приверженности средиземноморской диете для разработки индекса. Будет разработана кумулятивная переменная (диапазон 0–4), указывающая общее бремя классических факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (т. один факторный балл 1 и т. д.).

I) Критерии успеха вмешательства. Для оценки успеха вмешательства с олеуропеином в качестве основной переменной будет принято уменьшение глубины зондирования (PD) на 1 мм или более. Кроме того, в качестве второстепенных критериев успеха принимается снижение уровня прикрепления на 1 мм и более, а также снижение кровоточивости десен при зондировании более чем на 20%.

J) Статистический анализ Будет проведен описательный анализ основных изучаемых переменных. Для нормальных количественных переменных будут рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение или медиана и процентили в случае ненормальности. Качественные переменные будут выражаться с использованием абсолютных и относительных частот. Нормальность переменных будет проверена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, чтобы определить необходимость проведения преобразований (логарифмических и других) перед проведением сравнительных исследований. Чтобы изучить влияние лечения на различные переменные в одной и той же группе, будет использоваться критерий Стьюдента для связанных выборок. Для проведения сравнительных анализов в одно и то же время эксперимента между обеими экспериментальными группами будет использован критерий Стьюдента для независимых выборок.