通过服用富含橄榄叶橄榄苦苷的补充剂对老年牙周炎患者进行辅助治疗 (OLIVAGING)

为了计算样本量，GRANMO 工具 (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) 已经使用，考虑到 0.05 的 alpha 风险、双侧对比度、0.20 的 beta 风险、2.5 的差异标准偏差、基线和研究结束之间要检测的探测深度减少 1 mm 的最小差异，以及预测损失比例为 20% 跟踪。

治疗 所有患者将在基线时和治疗后 4 个月后接受完整的口腔检查。 初始治疗将在所有患者中进行，包括手动全口刮治和牙根规划，必要时使用超声波仪器。 该治疗将在口腔卫生指导下完成。 所有初始治疗程序将由同一位牙周病医生执行。

牙周治疗后，登记的志愿者将由第二位牙周病医生随机分配到两组中的一组。 对照组将接受含有安慰剂（仅赋形剂）的硬明胶胶囊，而实验组将接受相同的硬明胶胶囊，但含有 200 毫克橄榄叶提取物。 随机化将通过使用随机数图表（通过掷硬币）来完成，这将在第一个受试者注册时进行，下一个受试者将根据第一个受试者的分配分配到另一组。 安慰剂和胶囊将由同一人配发，受试者将收到关于其使用的口头和书面说明。 由于志愿者将被登记，他们将被分配连续的研究编号并提供足够一个月的胶囊。 在试验过程中，受试者将每 4 周来一次学院补充他们的胶囊。 胶囊摄入量将持续总共 4 个月。 将检查剩余的药物是否符合规定。 胶囊将在格拉纳达科技健康园的 CIDAF（Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales）制备。 橄榄提取物将从 Natac 公司（马德里，西班牙）获得。

样品收集和分析 所有数据收集和测定将在基线时和 4 个月后进行。

A) 口腔检查 牙周临床测量将包括是否存在龈上牙菌斑和牙龈探诊出血 (BOP)，以及牙周探诊深度 (PPD) 和龈缘退缩 (GM)。 参数将通过校准的牙周探针（Hu-Friedy®，Chicago，IL，USA）在每颗牙齿上的六个位置（近中颊、颊侧、远颊、远舌、舌和近中）进行测量，长 15 毫米，直径 0.35直径毫米。 临床依恋水平 (CAL) 将通过将衰退添加到 PDD 来计算。 剩余牙齿的数量也将被记录下来。 O´Leary 的斑块指数、Van der Velden 的出血指数也将被计算。 BOP 部位 <10%、PPD ≤3 mm、无红斑和水肿的患者将被视为牙周健康受试者。

B) 社会人口数据收集

1. 基本社会人口统计数据：包括年龄、性别、受教育年限。
2. 财务状况：参与者将被要求使用四分制报告他们过去三年的平均收入（低，不足以支付日常开支 = 1，中等，努力支付日常开支 = 2，好，足以支付日常开销=3，很好，很够日常开销=4）。
3. 吸烟状况：当前吸烟者将被定义为访谈时的吸烟者。 前吸烟者将被定义为以前吸烟但一年或更长时间没有吸烟的人。 其余参与者将被定义为偶尔吸烟者或非当前吸烟者。
4. 身体活动水平：将使用自我报告的国际身体活动问卷 (IPAQ) 以每周代谢当量 (MET) 分钟为单位进行评估。 每周报告至少 3 MET 分钟的人将被归类为身体活跃（最低限度活跃 - 或“健康增强身体活动 (HEPA) 活跃”）。 所有其他人将被定义为身体不活跃。 此外，将记录每周的身体活动频率。
5. 上个月的抑郁症状：将使用经过验证的缩短版自我报告老年抑郁量表 (GDS)（范围 0-20）对其进行评估。 0 和 4 之间的 GDS 分数将用于表示没有抑郁症，而 5-10 和 N 10 的分数将分别表示轻度和重度抑郁症。
6. 医疗保健用途：居住区内是否有私人医生办公室、公立或私立医疗保健中心或医院，以及每年定期检查健康状况的次数，都会被记录下来。
7. 成年人的社会参与：他们每周与家人、朋友的社会活动频率以及他们每年的短途旅行频率将为此目的而被记录下来。

C) 人体测量特征和血压

1. 将测量体重、身高和腰围。 将计算 BMI 和腰臀比。 超重定义为 BMI 在 25.0 和 29.9 kg/m2 之间，而肥胖定义为 BMI >29.9 kg/m2。
2. 血压：血压水平>140/90 mmHg 或使用抗高血压药物的患者将被归类为高血压。

D) 饮食习惯评估 饮食习惯的评估将基于半定量食物频率问卷 (FFQ)。 FFQ 将用于评估对地中海饮食的依从性水平，使用 MedDietScore（理论范围 0-55）。

E) 采血和分析 禁食 12 小时后，在坐位没有停滞的情况下，通过前臂静脉穿刺收集血样 (16 mL)。 全血样本将用于血液学评估。 将大部分血液抽取到含有 EDTA 的试管 (1 mg/ml) 中，通过以 1000 xg 离心 10 分钟分离血浆，并分成 250 μl 的等分试样，用于立即分析或在 -80 °C 下储存. 血液还将用于获得分离的血液单核细胞 (BMC) 以用于其他额外分析。 包含血浆或 BMC 的等分试样将保存在 -80º C 直至分析。

血液分析如下：

1. 生化评估：空腹血脂水平（包括高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、直接低密度脂蛋白胆固醇、极低密度胆固醇（VLDL）和甘油三酯（TG）、血浆葡萄糖、高敏 C 反应蛋白、LPa、皮质醇、纤维蛋白原和同型半胱氨酸水平将使用自动分析仪在血浆中测定。 根据美国糖尿病协会诊断标准，空腹血糖> 126 mg/dL、使用抗糖尿病药物或先前诊断为糖尿病的患者将被确定为 2 型糖尿病。 根据国家胆固醇教育计划成人治疗小组 III 指南，高胆固醇血症将定义为总血清胆固醇水平 >200 mg/dL 或使用降脂剂。
2. 血液学研究：全血样本中的血象和血细胞概况。
3. 循环促炎标志物：包括 IL-1β 和 IL-18 在内的多种炎症细胞因子的循环水平将通过商业多重试剂盒（Cytokine Panel 1B 25plex，Thermo Fisher Scientific）进行分析。 此外，活性 caspase-1 的蛋白质水平和 Nlrp3 (CIAS1) 和 caspase-1 的基因表达将分别通过蛋白质印迹和 RT-PCR 在分离的 PBMC 中测定，以评估炎性体活性。
4. 自噬标记物：MAP-LC3、ATG12、p62、TFEB、Beclin-1 以及 B 和 D 组织蛋白酶水平将通过蛋白质印迹法在分离的 PBMC 蛋白分离物中测定。 Beclin-1, y Maplc3 基因表达将通过 RT-PCR 在分离的 PBMC 中使用 β-肌动蛋白作为管家基因来确定。
5. 氧化应激标志物和抗氧化能力：将通过测定尿液中的 15-F2 异前列腺素来分析脂质损伤，通过测定血浆中的羰基蛋白来分析蛋白质损伤68，并通过测定尿液中的 8-羟基鸟苷 (8OHdG) 来分析 DNA 损伤. 此外，将通过使用手指上的血滴对诊所的受试者进行原位氧化还原状态的确定。 它将通过 Redoxsys 系统（Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA）进行，该系统还测量样品的抗氧化能力。 这是一种新颖的系统，可以可靠地测量生物样品中的总氧化还原电荷及其抗氧化能力。
6. 代谢组学研究：为了进行这种分析，首先提取不同样品的代谢物。 然后通过色谱分离存在于甲醇提取物中的分子。 洗脱液在 ESI-Q-TOF-MS/MS 系统中通过电喷雾进行监测98。 结果分析将与来自 Lleida 大学的 Reinald Pamplona 博士合作进行，我们多年来一直在这个问题上与他合作，并与他分享一系列关于代谢组学的研究和出版物。

F) 牙周微生物群研究。 在隔离区域后 30 秒内，通过将滤纸尖端放在牙周袋上，从 PPD 最高的三个部位收集龈下菌斑样本。

收集在干纸上的龈下菌斑样本将通过 PCR 进行分析，以评估是否存在已知的牙周病原体：牙龈磷单胞菌、福赛坦纳菌、牙髓密螺旋体、伴放线聚集杆菌、中间普氏菌、具核梭杆菌。 微生物群研究将使用 16S rDNA 大规模测序技术进行。 测序和生物信息学分析将由加拿大达尔豪斯大学的集成微生物组资源进行。

G) 尿液测定。

将收集空腹尿液并进行以下测定：

1. 氧化损伤标记物：8-羟基-2-脱氧鸟苷和总 F2-异前列烷将通过竞争性酶免疫测定法在尿液中测量。 结果将标准化为尿肌酐。
2. 橄榄苦苷代谢物浓度：与之前的研究一样，它们将通过 LC-ESI-MS/MS 进行量化。

H) 成功老化指数演算 成功老化指数 (SAI) 的潜在分数范围为 0 到 10，将用于评估研究参与者的老化。 完整的指数包括教育、财务状况、身体活动、BMI、GDS 分数、与朋友、家人一起参加社交活动、每年远足、CVD 风险因素分数和地中海饮食依从性水平来制定该指数。 将开发一个累积变量（范围 0-4），指示经典心血管疾病风险因素（即肥胖和高血压、糖尿病和高胆固醇血症病史）的总体负担（没有上述风险因素的参与者将获得 0 分，有一个因素得分 1，等等）。

I) 干预成功标准 评估橄榄苦苷干预是否成功，将以探诊深度 (PD) 减少 1 毫米或更多作为主要变量。 此外，作为次要成功标准，附着水平减少 1 毫米或更多，以及探诊牙龈出血减少 20% 以上。

J) 统计分析 将对研究的主要变量进行描述性分析。 对于正常的定量变量，将计算均值和标准差，或者在非正态的情况下计算中位数和百分位数。 定性变量将使用绝对频率和相对频率表示。 将使用 Kolmogorov-Smirnov 检验检查变量的正态性，以确定在进行比较研究之前是否需要进行转换（对数和其他）。 为了研究治疗对同一组不同变量的影响，将使用相关样本的学生 t 检验。 为了在两个实验组之间在相同的实验时间进行比较分析，将使用独立样本的学生 t 检验。