올리브 잎에서 추출한 Oleuropein이 풍부한 보충제 투여를 통한 노인 치주염 환자의 보조 치료 (OLIVAGING)

샘플 크기를 계산하기 위해 GRANMO 도구(https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) 알파 위험 0.05, 양측 대비, 베타 위험 0.20, 차이의 표준 편차 2.5, 기준선과 연구 종료 사이에 감지할 프로빙 깊이의 최소 차이 1mm 감소를 고려하여 사용되었습니다. 20% 트래킹의 예상 손실 비율.

치료 모든 환자는 기준선과 치료 후 4개월 후에 완전한 구강 검사를 받게 됩니다. 초기 치료는 모든 환자에서 수행되며 필요에 따라 손으로 그리고 초음파 기기를 사용하여 전체 구강 스케일링 및 치근 계획으로 구성됩니다. 이 치료는 구강 위생 지침으로 완료됩니다. 모든 초기 치료 절차는 동일한 치주과 의사가 수행합니다.

치주 치료 후 등록된 지원자는 두 번째 치주 전문의에 의해 두 그룹 중 하나에 무작위로 배정됩니다. 대조군은 위약(부형제만)이 포함된 경질 젤라틴 캡슐을 받는 반면, 실험군은 동일한 경질 젤라틴 캡슐에 올리브 잎 추출물 200mg을 함유합니다. 무작위 배정은 첫 번째 피험자 등록 시 무작위 숫자 차트(동전 던지기)를 사용하여 수행되며 첫 번째 피험자의 배정에 따라 다음 피험자는 다른 그룹에 배정됩니다. 위약과 캡슐은 모두 같은 사람이 분배하며 피험자에게는 사용에 대한 구두 및 서면 지침이 제공됩니다. 지원자가 등록되면 순차적인 연구 번호가 할당되고 한 달 동안 사용할 수 있는 캡슐이 제공됩니다. 피험자는 시험 기간 동안 4주마다 교수진을 방문하여 캡슐을 보충합니다. 캡슐 섭취는 총 4개월 동안 지속됩니다. 나머지 약물은 준수 여부를 확인합니다. 캡슐은 Granada의 Technological Health Park에 있는 CIDAF(Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales)에서 준비됩니다. 올리브 추출물은 Natac 회사(Madrid, España)에서 얻을 수 있습니다.

샘플 수집 및 분석 모든 데이터 수집 및 결정은 기준선과 4개월 후에 수행됩니다.

A) 구강 검사 치주 임상 측정에는 치은연부 플라크의 유무와 프로빙 시 잇몸 출혈(BOP), 치주 프로빙 깊이(PPD) 및 치은 변연 후퇴(GM)가 포함됩니다. 교정된 치주 프로브(Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA)를 사용하여 모든 치아의 6개 부위(mesiobuccal, buccal, distobuccal, distolingual, lingual 및 mesiolingual)에서 길이 15 mm 및 0.35 직경 mm. 임상적 애착 수준(CAL)은 PDD에 후퇴를 더하여 계산됩니다. 남은 치아의 개수도 기록됩니다. O´Leary의 플라크 지수, Van der Velden의 출혈 지수도 계산됩니다. BOP 부위 <10%, PPD ≤3mm, 홍반 및 부종이 없는 환자는 치주 건강 피험자로 간주됩니다.

B) 사회인구학적 데이터 수집

1. 기본 사회인구학적 데이터: 여기에는 연령, 성별, 교육 기간이 포함됩니다.
2. 재정 상태: 참가자는 4점 척도를 사용하여 지난 3년 동안의 평균 소득을 보고하도록 요청받습니다(낮음, 일비를 충당하기에 부적절함 = 1, 중간, 생활비를 충당하기 위해 열심히 노력함 = 2, 양호, 충당하기에 충분함). 일일 경비 = 3, 매우 좋음, 일일 경비를 충당하기에 매우 적절함 = 4).
3. 흡연 상태: 현재 흡연자는 인터뷰 당시 흡연자로 정의됩니다. 이전 흡연자는 이전에 흡연했지만 1년 이상 흡연하지 않은 사람으로 정의됩니다. 나머지 참가자는 비흡연자 또는 비흡연자로 정의됩니다.
4. 신체 활동 수준: 자가 보고 국제 신체 활동 설문지(IPAQ)를 사용하여 주당 대사량(MET)-분으로 평가됩니다. 주당 최소 3 MET-분을 보고한 사람은 신체 활동(최소 활동 - 또는 "건강 증진 신체 활동(HEPA) 활성")으로 분류됩니다. 다른 모든 사람들은 신체적으로 활동하지 않는 것으로 정의됩니다. 또한 매주 신체 활동 빈도가 기록됩니다.
5. 지난 달의 우울증 증상: 검증된 단축 자가 보고형 노인병 우울증 척도(GDS)(범위 0-20)를 사용하여 평가합니다. 0에서 4 사이의 GDS 점수는 우울증이 없음을 나타내는 데 사용되며, 5-10 및 N 10의 점수는 각각 경도 및 심한 우울증을 나타냅니다.
6. 의료 사용: 거주 지역의 개인 의사 진료소, 공립 또는 사립 건강 관리 센터 또는 병원의 존재 여부와 건강 상태 정기 검진을 위한 연간 방문 횟수가 기록됩니다.
7. 성인의 사회 참여: 이를 위해 가족, 친구와 함께하는 사회 활동의 주간 빈도 및 연간 소풍 빈도가 기록됩니다.

다) 인체 특성 및 혈압

1. 몸무게, 키, 허리둘레를 측정합니다. BMI와 허리-엉덩이 비율이 계산됩니다. 과체중은 BMI가 25.0~29.9kg/m2 사이인 것으로 정의되고 비만은 BMI >29.9kg/m2로 정의됩니다.
2. 혈압: 혈압 수치가 >140/90 mmHg이거나 항고혈압제를 사용하는 환자는 고혈압으로 분류됩니다.

D) 식습관 평가 식습관 평가는 반정량적 음식 빈도 설문지(FFQ)를 기반으로 합니다. FFQ는 지중해 식단에 대한 준수 수준을 평가하는 데 사용되며, MedDietScore(이론적 범위 0-55)가 사용되었습니다.

E) 혈액 샘플링 및 분석 혈액 샘플(16mL)은 앉은 자세에서 정체 없이 밤새도록 12시간 금식한 후 팔뚝 정맥 천자에 의해 수집됩니다. 전혈 샘플은 혈액학적 평가에 사용됩니다. 대부분의 혈액을 EDTA 함유 튜브(1 mg/ml)로 뽑아내고 혈장을 10분 동안 1000 xg에서 원심분리하여 분리하고 즉시 분석하거나 -80 °C에서 보관하기 위해 250 μl의 분취량으로 나눕니다. . 혈액은 또한 다른 추가 분석을 위해 분리된 혈액 단핵 세포(BMC)를 얻기 위해 사용됩니다. 혈장 또는 BMC를 모두 포함하는 분취량은 분석할 때까지 -80º C에서 보존됩니다.

혈액 분석은 다음과 같습니다.

1. 생화학 평가: 공복 혈중 지질 수치(고밀도 지단백-콜레스테롤(HDL), 저밀도 지단백-콜레스테롤(LDL), 직접 LDL-콜레스테롤, 초저밀도-콜레스테롤(VLDL) 및 트리글리세리드(TG), 혈장 포도당 포함) , 고감도 C 반응성 단백질, LPa, 코르티솔, 피브리노겐 및 호모시스테인 수치는 자동 분석기를 사용하여 혈장에서 결정됩니다. 공복 혈당 > 126 mg/dL을 나타내거나 항당뇨병 약물을 사용하거나 이전에 당뇨병 진단을 받은 환자는 미국 당뇨병 협회 진단 기준에 따라 제2형 당뇨병으로 결정됩니다. 고콜레스테롤혈증은 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III 가이드라인에 따라 총 혈청 콜레스테롤 수치 >200 mg/dL 또는 지질 저하제 사용으로 정의됩니다.
2. 혈액학적 연구: 전혈 샘플의 혈구도 및 혈액 세포 프로파일.
3. 순환 염증성 마커: IL-1β 및 IL-18을 포함하는 다중 염증성 사이토카인의 순환 수준을 상업용 멀티플렉스 키트(Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific)로 분석합니다. 또한 활성 caspase-1의 단백질 수준과 Nlrp3(CIAS1) 및 caspase-1의 유전자 발현은 inflammasome 활성을 평가하기 위해 각각 Western-Blotting 및 RT-PCR에 의해 분리된 PBMC에서 결정될 것입니다.
4. Autophagy 마커: MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 및 B 및 D 카텝신 수준은 분리된 PBMC 단백질 분리물에서 Western-Blotting에 의해 결정됩니다. Beclin-1, γ Maplc3 유전자 발현은 하우스키퍼 유전자로서 베타-액틴을 사용하여 분리된 PBMC에서 RT-PCR에 의해 결정될 것이다.
5. 산화 스트레스 마커 및 항산화 능력: 소변에서 15-F2 isoprostanes 측정을 통해 지질 손상, 혈장에서 카르보닐 단백질 측정으로 단백질 손상68, 소변에서 8-하이드록시구아노신(8OHdG) 측정을 통해 DNA 손상을 분석합니다. . 또한, 제자리 산화환원 상태의 결정은 손가락에서 혈액 방울을 사용하여 클리닉의 피험자에서 수행됩니다. 샘플의 항산화 능력도 측정하는 Redoxsys 시스템(Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA)을 통해 수행될 것이다. 이것은 생물학적 시료의 총 산화환원 전하와 항산화 능력을 사용할 수 없게 되기 전에 신뢰성 있게 측정하는 새로운 시스템입니다.
6. 대사체 연구: 이 분석을 수행하기 위해 다양한 샘플의 대사체가 먼저 추출됩니다. 그런 다음 메탄올 추출물에 존재하는 분자는 크로마토그래피로 분리됩니다. eluate는 electrospray98에 의해 ESI-Q-TOF-MS/MS 시스템에서 모니터링됩니다. 결과 분석은 Lleida 대학의 Reinald Pamplona 박사와 공동으로 수행될 예정입니다. 그는 수년간 이 문제에 대해 협력해 왔으며 대사체학에 대한 연구 및 간행물을 공유하고 있습니다.

F) 치주 미생물군 연구. 영역을 분리한 후 30초 동안 여과지 끝을 치주낭에 대고 PPD가 가장 높은 3개 부위에서 치은연하 플라그 샘플을 채취합니다.

건조 종이에서 수집된 치은연하 플라크 샘플을 PCR로 분석하여 알려진 peridontopathogens: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum의 존재를 평가합니다. 미생물 연구는 16S rDNA 질량 시퀀싱 기술을 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱 및 생물정보학적 분석은 캐나다 Dalhousie 대학의 Integrated Microbiome Resource에 의해 수행됩니다.

G) 소변 측정.

공복 소변을 수집하고 다음 결정을 수행합니다.

1. 산화적 손상 마커: 8-하이드록시-2-데옥시구아노신 및 총 F2-이소프로스테인은 경쟁적 효소 면역분석에 의해 소변에서 측정됩니다. 결과는 소변 크레아티닌으로 정상화됩니다.
2. 올러유러핀 대사산물 농도: 이전 연구에서와 같이 LC-ESI-MS/MS로 정량화됩니다.

H) 성공적인 노화 지수 계산 0에서 10까지의 잠재적 점수를 갖는 성공적인 노화 지수(SAI)는 연구 참가자의 노화를 평가하는 데 사용됩니다. 전체 지수는 교육, 재정 상태, 신체 활동, BMI, GDS 점수, 친구 및 가족과의 사회 활동 참여, 연간 여행, CVD 위험 요소 점수 및 지중해 식단 준수 수준을 포함하여 지수를 개발합니다. 고전적 심혈관 질환 위험 요인(즉, 비만 및 고혈압, 당뇨병 및 고콜레스테롤혈증의 병력)의 전반적인 부담을 나타내는 누적 변수(범위 0-4)가 개발될 것입니다(앞서 언급한 위험 요인이 전혀 없는 참가자는 점수 0을 받게 됩니다. 하나의 요인 점수 1 등).

I) 중재 성공 기준 oleuropein 중재의 성공 여부를 평가하기 위해 프로빙 깊이(PD)가 1mm 이상 감소하는 것을 주요 변수로 간주합니다. 또한 2차 성공 기준으로 부착 수준이 1mm 이상 감소하고 탐침 시 치은 출혈이 20% 이상 감소합니다.

J) 통계 분석 연구된 주요 변수에 대한 기술 분석이 수행됩니다. 정상적인 양적 변수의 경우 평균 및 표준편차를 계산하거나 비정규성의 경우 중앙값 및 백분위수를 계산합니다. 질적 변수는 절대 및 상대 빈도를 사용하여 표현됩니다. 비교 연구를 수행하기 전에 변환(로그 및 기타)을 수행할 필요성을 결정하기 위해 Kolmogorov-Smirnov 테스트로 변수의 정규성을 확인합니다. 동일한 그룹의 다른 변수에 대한 치료 효과를 연구하기 위해 관련 샘플에 대한 스튜던트 t-테스트가 사용됩니다. 동일한 실험 시간에 두 실험 그룹 간에 비교 분석을 수행하기 위해 독립 샘플에 대한 스튜던트 t-테스트가 사용됩니다.