Tratamiento adyuvante en pacientes ancianos con periodontitis mediante la administración de un suplemento rico en oleuropeína procedente de la hoja de olivo (OLIVAGING)

Para calcular el tamaño de la muestra se utiliza la herramienta GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) se ha utilizado, considerando un riesgo alfa de 0,05, un contraste bilateral, un riesgo beta de 0,20, una desviación estándar de las diferencias de 2,5, una diferencia mínima de 1 mm de reducción de la profundidad de sondaje a detectar entre el inicio y el final del estudio, y una proporción prevista de pérdida del 20% de seguimiento.

Tratamientos Todos los pacientes recibirán un examen oral completo al inicio y después de 4 meses después del tratamiento. La terapia inicial se realizará en todos los pacientes y consistirá en el raspado y alisado radicular de toda la boca a mano y con instrumentación ultrasónica según sea necesario. Este tratamiento se completará con las instrucciones de higiene bucal. Todos los procedimientos de terapia inicial serán realizados por el mismo periodoncista.

Después del tratamiento periodontal, un segundo periodoncista asignará aleatoriamente a los voluntarios inscritos a uno de dos grupos. El grupo de control recibirá cápsulas de gelatina dura que contienen placebo (solo los excipientes), mientras que el grupo experimental recibirá las mismas cápsulas de gelatina dura pero que contienen 200 mg de extracto de hoja de olivo. La aleatorización se realizará mediante el uso de tablas de números aleatorios (mediante el lanzamiento de una moneda), que se realizará en el momento de la inscripción del primer sujeto, y el siguiente sujeto se asignará al otro grupo en función de la asignación del primer sujeto. Tanto el placebo como las cápsulas serán dispensados ​​por la misma persona, y los sujetos recibirán instrucciones verbales y escritas sobre su uso. A medida que se inscriban voluntarios, se les asignarán números de estudio secuenciales y se les proporcionarán sus cápsulas, suficientes para un mes. Los sujetos acudirán a la Facultad cada 4 semanas durante el transcurso del ensayo para reponer sus cápsulas. La toma de cápsulas tendrá una duración total de 4 meses. Se verificará el cumplimiento de los medicamentos restantes. Las cápsulas se prepararán en el CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) del Parque Tecnológico de la Salud de Granada. El extracto de aceituna se obtendrá de la empresa Natac (Madrid, España).

Recopilación y análisis de muestras Toda la recopilación de datos y las determinaciones se realizarán al inicio y después de 4 meses.

A) Exámenes orales Las mediciones clínicas periodontales incluirán la presencia o ausencia de placa dental supragingival y sangrado gingival al sondaje (BOP), así como la profundidad de sondaje periodontal (PPD) y la recesión del margen gingival (GM). Los parámetros se medirán en seis sitios (mesiovestibular, bucal, distovestibular, distolingual, lingual y mesiolingual) en cada diente por medio de una sonda periodontal calibrada (Hu-Friedy®, Chicago, IL, EE. UU.), de 15 mm de longitud y 0,35 mm de diámetro. El nivel de apego clínico (CAL) se calculará sumando la recesión al PDD. También se registrará el número de dientes restantes. También se calculará el índice de placa de O´Leary, el índice de sangrado de Van der Velden. Los pacientes con sitio BOP < 10%, PPD ≤ 3 mm, ausencia de eritema y edema serán considerados sujetos periodontalmente sanos.

B) Recogida de datos sociodemográficos

1. Datos sociodemográficos básicos: estos incluirán edad, sexo, años de educación.
2. Estado financiero: se les pedirá a los participantes que informen su ingreso medio durante los tres años anteriores utilizando una escala de cuatro puntos (bajo, inadecuado para cubrir los gastos diarios = 1, medio, esforzándose por cubrir los gastos diarios = 2, bueno, adecuado para cubrir gastos diarios = 3, muy bueno, muy adecuado para cubrir los gastos diarios = 4).
3. Tabaquismo: los fumadores actuales se definirán como fumadores en el momento de la entrevista. Se considerarán exfumadores aquellos que habían fumado anteriormente, pero que no lo hacían desde hacía un año o más. El resto de participantes se definirán como fumadores ocasionales o no actuales.
4. Nivel de actividad física: se evaluará en equivalente metabólico (MET)-minutos por semana, utilizando el Cuestionario Internacional de Actividad Física (IPAQ) autoadministrado. Aquellos que informaron al menos 3 MET-minutos por semana serán clasificados como físicamente activos (mínimamente activos, o "actividad física para mejorar la salud (HEPA) activa"). Todos los demás se definirán como físicamente inactivos. Además, se registrará la frecuencia semanal de actividad física.
5. Síntomas de depresión del último mes: se evaluarán mediante una escala de depresión geriátrica (GDS) abreviada y autonotificada (rango 0-20). Se utilizará una puntuación de GDS entre 0 y 4 para indicar que no hay depresión, mientras que las puntuaciones de 5 a 10 y N 10 indicarán depresión leve y grave, respectivamente.
6. Uso sanitario: se registrará la presencia de consultas médicas privadas, centros de salud u hospitales públicos o privados en el ámbito de residencia, así como el número anual de visitas para control periódico del estado de salud.
7. Participación social de los adultos: para este fin se registrará la frecuencia semanal de sus actividades sociales con su familia, sus amigos, así como su frecuencia anual de excursiones.

C) Características antropométricas y presión arterial

1. Se medirá el peso, la altura y la circunferencia de la cintura. Se calculará el IMC y la relación cintura-cadera. El sobrepeso se definirá como un IMC entre 25,0 y 29,9 kg/m2, mientras que la obesidad se definirá como un IMC > 29,9 kg/m2.
2. Presión arterial: los pacientes con niveles de presión arterial > 140/90 mmHg o que utilicen medicamentos antihipertensivos serán clasificados como hipertensos.

D) Evaluación de hábitos alimentarios La evaluación de hábitos alimentarios se basará en un cuestionario semicuantitativo de frecuencia de consumo de alimentos (FFQ). Se utilizará FFQ para evaluar el nivel de adherencia a la dieta mediterránea, se utilizó el MedDietScore (rango teórico 0-55).

E) Toma de muestra y análisis de sangre Las muestras de sangre (16 ml) se recolectarán por venopunción del antebrazo después de 12 h de ayuno nocturno, sin estasis en la posición sentada. Las muestras de sangre entera se utilizarán para evaluaciones hematológicas. La mayor parte de la sangre se extraerá en tubos que contienen EDTA (1 mg/ml) y el plasma se aislará mediante centrifugación a 1000 xg, durante 10 min y se dividirá en alícuotas de 250 μl para análisis inmediato o para almacenamiento a -80 °C. . La sangre también se utilizará para obtener células mononucleares de sangre aisladas (BMC) para otros análisis adicionales. Las alícuotas que contengan tanto plasma como BMC se conservarán a -80 ºC hasta su análisis.

Los análisis de sangre serán los siguientes:

1. Evaluaciones bioquímicas: niveles de lípidos en sangre en ayunas (incluyendo colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL), colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL), colesterol LDL directo, colesterol de muy baja densidad (VLDL) y triglicéridos (TG), glucosa plasmática , los niveles de proteína C reactiva de alta sensibilidad, LPa, cortisol, fibrinógeno y homocisteína se determinarán en plasma utilizando un analizador automático. Los pacientes que muestren glucosa en sangre en ayunas > 126 mg/dL, que usen medicación antidiabética o con un diagnóstico previo de diabetes se determinarán como diabetes mellitus tipo 2 de acuerdo con los criterios de diagnóstico de la Asociación Estadounidense de Diabetes. La hipercolesterolemia se definirá como niveles de colesterol sérico total >200 mg/dL o el uso de agentes reductores de lípidos, de acuerdo con las pautas del Panel III de Tratamiento de Adultos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol.
2. Estudio hematológico: hemograma y perfil hematológico en muestras de sangre total.
3. Marcadores proinflamatorios circulantes: los niveles circulantes de múltiples citocinas inflamatorias, incluidas IL-1β e IL-18, se analizarán mediante un kit multiplex comercial (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Además, los niveles de proteína de caspasa-1 activa y la expresión génica de Nlrp3 (CIAS1) y caspasa-1 se determinarán en PBMC aisladas mediante Western-Blotting y RT-PCR, respectivamente, para evaluar la actividad del inflamasoma.
4. Marcadores de autofagia: MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 y los niveles de catepsinas B y D se determinarán mediante transferencia Western en aislados de proteína de PBMC. Las expresiones de los genes Beclin-1, y Maplc3 se determinarán mediante RT-PCR en PBMC aisladas utilizando beta-actina como gen ama de llaves.
5. Marcadores de estrés oxidativo y capacidad antioxidante: se analizará el daño en lípidos mediante la determinación en orina de 15-F2 isoprostanos, el daño en proteínas mediante la determinación de carbonilproteínas en plasma68 y el daño en el ADN mediante la determinación en orina de 8-hidroxiguanosina (8OHdG) . Además, la determinación del estado redox in situ se realizará en los sujetos en la clínica utilizando una gota de sangre de un dedo. Se realizará a través del sistema Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Englewood, EE. UU.), que también mide la capacidad antioxidante de la muestra. Se trata de un novedoso sistema que mide con una fiabilidad hasta ahora no disponible la carga redox total en muestras biológicas así como la capacidad antioxidante de las mismas.
6. Estudio metabolómico: para realizar este análisis, en primer lugar se extraen los metabolitos de las diferentes muestras. Luego, las moléculas presentes en el extracto metanólico se separan por cromatografía. El eluato se monitorea en un sistema ESI-Q-TOF-MS/MS por electrospray98. El análisis de resultados se realizará en colaboración con el Dr. Reinald Pamplona, ​​de la Universidad de Lleida, con quien colaboramos en este tema desde hace años y con quien compartimos línea de investigación y publicaciones sobre metabolómica.

F) Estudio de microbiota periodontal. Las muestras de placa subgingival se recolectarán de los tres sitios con los PPD más altos colocando en la bolsa periodontal la punta de un papel de filtro durante 30 s después de aislar la zona.

Las muestras de placa subgingival recogidas en papeles secos se analizarán mediante PCR para evaluar la presencia de periodontopatógenos conocidos: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Los estudios de microbiota se realizarán mediante técnicas de secuenciación masiva de ADNr 16S. La secuenciación y el análisis bioinformático serán realizados por Integrated Microbiome Resource, de la Universidad de Dalhousie, en Canadá.

G) Determinaciones en orina.

Se recogerá orina en ayunas y se realizarán las siguientes determinaciones:

1. Marcadores de daño oxidativo: 8-hidroxi-2-desoxiguanosina y F2-isoprostanos totales se medirán en orina mediante un inmunoensayo enzimático competitivo. Los resultados se normalizarán a la creatinina urinaria.
2. Concentración de metabolitos de oleuropeína: se cuantificarán por LC-ESI-MS/MS como en estudios previos.

H) Cálculo del índice de envejecimiento exitoso Se empleará el índice de envejecimiento exitoso (SAI), con puntajes potenciales que van de 0 a 10, para evaluar el envejecimiento de los participantes del estudio. El índice completo abarca la educación, el estado financiero, la actividad física, el IMC, la puntuación GDS, la participación en actividades sociales con amigos, con la familia, las excursiones anuales, la puntuación de los factores de riesgo de ECV y el nivel de adherencia a la dieta mediterránea para desarrollar el índice. Se desarrollará una variable acumulativa (rango 0-4) que indique la carga general de los factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares clásicas (es decir, obesidad y antecedentes de hipertensión, diabetes e hipercolesterolemia) (los participantes que no tengan ninguno de los factores de riesgo antes mencionados recibirán una puntuación de 0, teniendo puntuación de un factor 1, etc.).

I) Criterios de éxito de la intervención Para evaluar el éxito de la intervención con oleuropeína se tomará como variable principal la reducción de 1 mm o más de la profundidad de sondaje (DP). Además, y como criterios secundarios de éxito, se tomará una reducción de 1 mm o más en el nivel de inserción, así como una reducción de más del 20% del sangrado gingival al sondaje.

J) Análisis estadístico Se realizará un análisis descriptivo de las principales variables estudiadas. Para variables cuantitativas normales se calculará la media y desviación estándar, o la mediana y percentiles en caso de no normalidad. Las variables cualitativas se expresarán mediante frecuencias absolutas y relativas. Se comprobará la normalidad de las variables con la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar la necesidad de realizar transformaciones (logarítmicas y otras) antes de realizar los estudios de comparación. Para estudiar el efecto del tratamiento sobre las diferentes variables en un mismo grupo se utilizará la prueba t de Student para muestras relacionadas. Para realizar análisis comparativos en el mismo tiempo experimental entre ambos grupos experimentales se utilizará la prueba t de Student para muestras independientes.