Tratamento Adjuvante em Idosos com Periodontite Através da Administração de Suplemento Rico em Oleuropeína da Folha de Oliveira (OLIVAGING)

Para calcular o tamanho da amostra, a ferramenta GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) foi usado, considerando um risco alfa de 0,05, um contraste bilateral, um risco beta de 0,20, um desvio padrão das diferenças de 2,5, uma diferença mínima de 1 mm de redução na profundidade de sondagem a ser detectada entre a linha de base e o final do estudo, e uma proporção prevista de perda de rastreamento de 20%.

Tratamentos Todos os pacientes receberão um exame oral completo no início e 4 meses após o tratamento. A terapia inicial será realizada em todos os pacientes e consistirá em raspagem bucal completa e alisamento radicular manual e com instrumentação ultrassônica, conforme necessário. Este tratamento será completado com instruções de higiene oral. Todos os procedimentos de terapia inicial serão realizados pelo mesmo periodontista.

Após o tratamento periodontal, os voluntários inscritos serão aleatoriamente designados para um dos dois grupos por um segundo periodontista. O grupo controle receberá cápsulas de gelatina dura contendo placebo (somente os excipientes), enquanto o grupo experimental receberá as mesmas cápsulas de gelatina dura, mas contendo 200 mg de extrato de folha de oliveira. A randomização será feita por meio de tabelas de números aleatórios (por sorteio), que serão realizadas no momento da inscrição do primeiro sujeito, e o próximo sujeito será atribuído ao outro grupo com base na atribuição do primeiro sujeito. Tanto o placebo quanto as cápsulas serão dispensados ​​pela mesma pessoa, e os sujeitos receberão instruções verbais e escritas sobre seu uso. À medida que os voluntários forem inscritos, eles receberão números de estudo sequenciais e receberão suas cápsulas, suficientes para um mês. Os indivíduos virão ao corpo docente a cada 4 semanas durante o período do teste para reabastecer suas cápsulas. A ingestão de cápsulas durará um total de 4 meses. Os medicamentos restantes serão verificados quanto à conformidade. As cápsulas serão preparadas no CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) do Parque Tecnológico de Saúde de Granada. O extrato de azeitona será obtido da empresa Natac (Madrid, España).

Coleta e análises de amostras Todas as coletas e determinações de dados serão realizadas no início e após 4 meses.

A) Exames bucais As medições clínicas periodontais incluirão a presença ou ausência de placa dentária supragengival e sangramento gengival à sondagem (BOP), bem como profundidade de sondagem periodontal (PPD) e recessão da margem gengival (GM). Os parâmetros serão medidos em seis locais (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, disto-lingual, lingual e mésio-lingual) em cada dente por meio de uma sonda periodontal calibrada (Hu-Friedy®, Chicago, IL, EUA), 15 mm de comprimento e 0,35 mm de diâmetro. O nível de inserção clínica (CAL) será calculado adicionando a recessão ao PDD. O número de dentes remanescentes também será registrado. O índice de placa de O´Leary, o índice de sangramento de Van der Velden também serão calculados. Pacientes com sítio BOP <10%, PPD ≤3 mm, ausência de eritema e edema serão considerados indivíduos periodontais saudáveis.

B) Coleta de dados sociodemográficos

1. Dados sociodemográficos básicos: incluirão idade, sexo, anos de escolaridade.
2. Situação financeira: será solicitado aos participantes que relatem sua renda média durante os últimos três anos usando uma escala de quatro pontos (baixa, inadequada para cobrir as despesas diárias = 1, média, esforçando-se para cobrir as despesas diárias = 2, boa, adequada para cobrir despesas diárias = 3, muito bom, muito adequado para cobrir as despesas diárias = 4).
3. Tabagismo: os fumantes atuais serão definidos como fumantes no momento da entrevista. Ex-fumantes serão definidos como aqueles que fumaram anteriormente, mas não fumaram por um ano ou mais. Os restantes participantes serão definidos como fumadores ocasionais ou não fumadores.
4. Nível de atividade física: será avaliado em equivalente metabólico (MET)-minutos por semana, por meio do Questionário Internacional de Atividade Física autorreferida (IPAQ). Aqueles que relataram pelo menos 3 MET-minutos por semana serão classificados como fisicamente ativos (minimamente ativos - ou "atividade física para melhorar a saúde (HEPA) ativa"). Todos os outros serão definidos como fisicamente inativos. Além disso, a frequência semanal de atividade física será registrada.
5. Sintomas de depressão do último mês: eles serão avaliados usando uma Escala de Depressão Geriátrica (GDS) abreviada e validada de autorrelato (GDS) (intervalo de 0-20). Uma pontuação GDS entre 0 e 4 será usada para indicar ausência de depressão, enquanto pontuações de 5-10 e N 10 indicarão depressão leve e grave, respectivamente.
6. Utilização de cuidados de saúde: será registada a presença de consultórios médicos privados, centros de saúde ou hospitais públicos ou privados na área de residência, bem como o número anual de consultas para controlo regular do estado de saúde.
7. Participação social do adulto: a frequência semanal de suas atividades sociais com a família, seus amigos, bem como a frequência anual de excursões serão registradas para esse fim.

C) Características antropométricas e pressão arterial

1. Serão medidos peso, altura e circunferência da cintura. IMC e relação cintura-quadril serão calculados. O sobrepeso será definido como IMC entre 25,0 e 29,9 kg/m2, enquanto a obesidade será definida como IMC >29,9 kg/m2.
2. Pressão arterial: serão classificados como hipertensos pacientes com níveis pressóricos >140/90 mmHg ou em uso de medicamentos anti-hipertensivos.

D) Avaliação dos hábitos alimentares A avaliação dos hábitos alimentares será baseada na aplicação de um questionário semi-quantitativo de frequência alimentar (QFA). O QFA será utilizado para avaliar o nível de adesão à dieta mediterrânea, foi utilizado o MedDietScore (intervalo teórico 0-55).

E) Coleta e análise de sangue Amostras de sangue (16 mL) serão coletadas por punção venosa do antebraço após jejum noturno de 12 horas, sem estase na posição sentada. Amostras de sangue total serão utilizadas para avaliações hematológicas. A maior parte do sangue será coletada em tubos contendo EDTA (1 mg/ml) e o plasma será isolado por centrifugação a 1000 xg, por 10 min e dividido em alíquotas de 250 μl para análise imediata ou para armazenamento a -80 °C . O sangue também será utilizado para a obtenção de células mononucleares (BMCs) isoladas do sangue para outras análises adicionais. Alíquotas contendo ambos, plasma ou BMCs, serão preservadas a -80º C até as análises.

As análises de sangue serão as seguintes:

1. Avaliações bioquímicas: níveis de lipídios no sangue em jejum (incluindo colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL), colesterol LDL direto, colesterol de densidade muito baixa (VLDL) e triglicerídeos (TG), glicose plasmática , os níveis de proteína C reativa de alta sensibilidade, LPa, cortisol, fibrinogênio e homocisteína serão determinados no plasma usando um analisador automático. Pacientes com glicemia de jejum > 126 mg/dL, em uso de medicação antidiabética ou com diagnóstico prévio de diabetes serão considerados diabetes mellitus tipo 2 de acordo com os critérios diagnósticos da American Diabetes Association. A hipercolesterolemia será definida como níveis séricos totais de colesterol >200 mg/dL ou uso de agentes hipolipemiantes, de acordo com as diretrizes do National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III.
2. Estudo hematológico: hemograma e perfil de células sanguíneas em amostras de sangue total.
3. Marcadores pró-inflamatórios circulantes: os níveis circulantes de múltiplas citocinas inflamatórias, incluindo IL-1β e IL-18, serão analisados ​​por um kit multiplex comercial (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Além disso, os níveis proteicos da caspase-1 ativa e a expressão gênica de Nlrp3 (CIAS1) e caspase-1 serão determinados em PBMCs isoladas por Western-Blotting e RT-PCR, respectivamente, para avaliar a atividade do inflamassoma.
4. Os níveis de marcadores de autofagia: MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 e catepsinas B e D serão determinados por Western-Blotting em isolados de proteínas de PBMC. As expressões gênicas de Beclin-1, y Maplc3 serão determinadas por RT-PCR em PBMCs isoladas usando beta-actina como gene caseiro.
5. Marcadores de estresse oxidativo e capacidade antioxidante: serão analisados ​​danos a lipídeos pela determinação na urina de 15-F2 isoprostanos, danos às proteínas pela determinação de proteínas carboniladas no plasma68 e danos ao DNA pela determinação na urina de 8-hidroxiguanosina (8OHdG) . Além disso, a determinação do estado redox in situ será realizada nos indivíduos na clínica por meio de uma gota de sangue de um dedo. Será realizada através do sistema Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Englewood, EUA), que também mede a capacidade antioxidante da amostra. Este é um novo sistema que mede com confiabilidade antes não disponível a carga redox total em amostras biológicas, bem como a capacidade antioxidante das mesmas.
6. Estudo metabolômico: para realizar estas análises, primeiro extraem-se os metabólitos das diferentes amostras. Em seguida, as moléculas presentes no extrato metanólico são separadas por cromatografia. O eluato é monitorado em sistema ESI-Q-TOF-MS/MS por eletrospray98. A análise dos resultados será realizada em colaboração com o Dr. Reinald Pamplona, ​​da Universidade de Lérida, com quem colaboramos neste tema há anos e com quem compartilhamos uma linha de pesquisa e publicações sobre metabolômica.

F) Estudo da microbiota periodontal. Amostras de placa subgengival serão coletadas dos três locais com os maiores PPDs colocando na bolsa periodontal a ponta de um papel filtro durante 30 s após isolar a zona.

Amostras de placa subgengival coletadas em papéis secos serão analisadas por PCR para avaliar a presença de peridontopatógenos conhecidos: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Os estudos da microbiota serão realizados utilizando técnicas de sequenciamento em massa do 16S rDNA. O sequenciamento e a análise bioinformática serão realizados pelo Integrated Microbiome Resource, da Universidade de Dalhousie, no Canadá.

G) Determinações na urina.

A urina em jejum será coletada e as seguintes determinações serão realizadas:

1. Marcadores de danos oxidativos: 8-hidroxi-2-desoxiguanosina e F2-isoprostanos totais serão medidos na urina por um imunoensaio enzimático competitivo. Os resultados serão normalizados para creatinina urinária.
2. Concentração dos metabólitos da oleuropeína: serão quantificados por LC-ESI-MS/MS como em estudos anteriores.

H) Cálculo do Índice de Envelhecimento de Sucesso O Índice de Envelhecimento de Sucesso (SAI), com escores potenciais variando de 0 a 10, será empregado para avaliar o envelhecimento dos participantes do estudo. O índice completo abrange educação, situação financeira, atividade física, IMC, pontuação GDS, participação em atividades sociais com amigos, com a família, excursões anuais, pontuação de fatores de risco cardiovascular e nível de adesão à dieta mediterrânea para desenvolver o índice. Será desenvolvida uma variável cumulativa (faixa 0-4) indicando a carga geral dos fatores de risco clássicos de doença cardiovascular (ou seja, obesidade e história de hipertensão, diabetes e hipercolesterolemia) (participantes sem nenhum dos fatores de risco mencionados acima receberão pontuação 0, tendo um fator pontua 1, etc.).

I) Critérios de sucesso da intervenção Para avaliar o sucesso da intervenção com oleuropeína, a redução de 1 mm ou mais na profundidade de sondagem (PD) será considerada como variável principal. Além disso, e como critério secundário de sucesso, será considerada uma redução de 1 mm ou mais no nível de inserção, bem como uma redução de mais de 20% no sangramento gengival à sondagem.

J) Análise estatística Será realizada uma análise descritiva das principais variáveis ​​estudadas. Para variáveis ​​quantitativas normais, serão calculados a média e o desvio padrão, ou a mediana e os percentis no caso de não normalidade. As variáveis ​​qualitativas serão expressas por frequências absolutas e relativas. A normalidade das variáveis ​​será verificada com o teste de Kolmogorov-Smirnov para determinar a necessidade de realizar transformações (logarítmicas e outras) antes de realizar os estudos de comparação. Para estudar o efeito do tratamento nas diferentes variáveis ​​de um mesmo grupo, será utilizado o teste t de Student para amostras relacionadas. Para a realização de análises comparativas no mesmo tempo experimental entre os dois grupos experimentais, será utilizado o teste t de Student para amostras independentes.