Adjuvantní léčba u starších pacientů s paradentózou podáváním doplňku bohatého na oleuropein z olivového listu (OLIVAGING)

Chcete-li vypočítat velikost vzorku, nástroj GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) byl použit s uvážením rizika alfa 0,05, oboustranného kontrastu, rizika beta 0,20, standardní odchylky rozdílů 2,5, minimálního rozdílu o 1 mm snížení hloubky sondování, které má být detekováno mezi výchozí hodnotou a koncem studie, a předpokládaný podíl ztráty 20 % sledování.

Léčba Všichni pacienti podstoupí kompletní orální vyšetření na začátku a po 4 měsících po léčbě. Počáteční terapie bude provedena u všech pacientů a bude sestávat z celoústního škálování a plánování kořenů ručně a podle potřeby pomocí ultrazvukových přístrojů. Toto ošetření bude doplněno instrukcemi o ústní hygieně. Všechny procedury úvodní terapie bude provádět stejný parodontolog.

Po ošetření parodontu budou zařazení dobrovolníci náhodně rozděleni do jedné ze dvou skupin druhým parodontologem. Kontrolní skupina dostane tvrdé želatinové kapsle obsahující placebo (pouze pomocné látky), zatímco experimentální skupina dostane stejné tvrdé želatinové kapsle, ale obsahující 200 mg extraktu z olivových listů. Randomizace bude provedena pomocí tabulek náhodných čísel (hozením mincí), která bude provedena v době zápisu prvního subjektu a další subjekt bude zařazen do další skupiny na základě zadání prvního subjektu. Placebo i tobolky bude vydávat stejná osoba a subjekty dostanou ústní a písemné pokyny k jeho použití. Jako dobrovolníci budou zapsáni, budou jim přidělena sekvenční studijní čísla a budou jim poskytnuty jejich kapsle, které postačí na jeden měsíc. Subjekty budou přicházet na fakultu každé 4 týdny v průběhu zkoušky, aby si doplnily kapsle. Příjem kapslí bude trvat celkem 4 měsíce. Zbývající léky budou zkontrolovány na dodržování. Kapsle budou připravovány v CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) v Technologickém zdravotním parku v Granadě. Olivový extrakt bude získán od společnosti Natac (Madrid, Španělsko).

Sběr vzorků a analýzy Všechny sběry dat a stanovení budou prováděny na začátku a po 4 měsících.

A) Orální vyšetření Periodontální klinická měření budou zahrnovat přítomnost nebo nepřítomnost supragingiválního zubního plaku a gingiválního krvácení při sondování (BOP), stejně jako hloubku periodontálního sondování (PPD) a recesi gingiválního okraje (GM). Parametry budou měřeny na šesti místech (meziobukální, bukální, distobukální, distolingvální, lingvální a mezolingvální) na každém zubu pomocí kalibrované periodontální sondy (Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA), délky 15 mm a 0,35 mm v průměru. Úroveň klinického připojení (CAL) bude vypočítána přidáním recese k PDD. Zaznamená se také počet zbývajících zubů. Vypočítá se také O´Learyho index plaku, Van der Veldenův index krvácivosti. Pacienti s lokalizací BOP < 10 %, PPD ≤ 3 mm, erytémem a nepřítomností edému budou považováni za pacienty se zdravým periodontem.

B) Sběr sociodemografických dat

1. Základní sociodemografické údaje: budou zahrnovat věk, pohlaví, roky vzdělání.
2. Finanční stav: účastníci budou požádáni, aby uvedli svůj průměrný příjem za předchozí tři roky pomocí čtyřbodové škály (nízký, neadekvátní k pokrytí denních výdajů = 1, střední, snažící se pokrýt denní výdaje = 2, dobrý, dostatečný k pokrytí denní výdaje = 3, velmi dobré, velmi dostatečné na pokrytí denních výdajů = 4).
3. Stav kuřáků: současní kuřáci budou v době rozhovoru definováni jako kuřáci. Bývalí kuřáci budou definováni jako ti, kteří dříve kouřili, ale nekouřili tak rok nebo déle. Zbývající účastníci budou definováni jako příležitostní nebo neaktuální kuřáci.
4. Úroveň fyzické aktivity: bude vyhodnocena v metabolických ekvivalentech (MET)-minutách za týden pomocí vlastního dotazníku International Physical Activity Questionnaire (IPAQ). Ti, kteří uvedli alespoň 3 MET-minuty týdně, budou klasifikováni jako fyzicky aktivní (minimálně aktivní – nebo „aktivní fyzická aktivita zvyšující zdraví (HEPA)“). Všichni ostatní budou definováni jako fyzicky neaktivní. Dále bude zaznamenávána týdenní frekvence pohybové aktivity.
5. Příznaky deprese z minulého měsíce: budou hodnoceny pomocí ověřené zkrácené škály geriatrické deprese (GDS) (rozmezí 0–20) s vlastní zprávou. Skóre GDS mezi 0 a 4 bude použito k označení žádné deprese, zatímco skóre 5-10 a N 10 bude indikovat mírnou a těžkou depresi.
6. Využití zdravotní péče: bude evidována přítomnost soukromých ordinací lékařů, veřejných či soukromých zdravotnických středisek nebo nemocnic v místě bydliště a také roční počet návštěv na pravidelné kontroly zdravotního stavu.
7. Sociální participace dospělých: za tímto účelem bude zaznamenávána týdenní frekvence jejich společenských aktivit s rodinou, přáteli a také roční frekvence exkurzí.

C) Antropometrické charakteristiky a krevní tlak

1. Změří se váha, výška a obvod pasu. Vypočítá se BMI a poměr pasu a boků. Nadváha bude definována jako BMI mezi 25,0 a 29,9 kg/m2, zatímco obezita bude definována jako BMI >29,9 kg/m2.
2. Krevní tlak: pacienti s hladinami krevního tlaku > 140/90 mmHg nebo užívající antihypertenzní léky budou klasifikováni jako hypertenzní.

D) Hodnocení stravovacích návyků Hodnocení stravovacích návyků bude založeno na semikvantitativním dotazníku o frekvenci potravin (FFQ). Pro hodnocení úrovně adherence ke středomořské dietě bude použito FFQ, bylo použito MedDietScore (teoretické rozmezí 0-55).

E) Odběr a analýza krve Vzorky krve (16 ml) se odeberou venepunkcí z předloktí po 12 hodinách nalačno přes noc, bez stáze v sedě. Pro hematologická hodnocení budou použity vzorky plné krve. Většina krve bude odebrána do zkumavek obsahujících EDTA (1 mg/ml) a plazma bude izolována centrifugací při 1000 xg po dobu 10 minut a rozdělena na alikvoty po 250 μl pro okamžitou analýzu nebo pro skladování při -80 °C . Krev bude také použita pro získání izolovaných krevních mononukleárních buněk (BMC) pro další dodatečné analýzy. Alikvoty obsahující obojí, plazmu nebo BMC, budou uchovány při -80 °C až do analýzy.

Rozbory krve budou následující:

1. Biochemická hodnocení: hladiny krevních lipidů nalačno (včetně lipoprotein-cholesterolu s vysokou hustotou (HDL), lipoprotein-cholesterolu s nízkou hustotou (LDL), přímého LDL-cholesterolu, velmi nízké hustoty cholesterolu (VLDL) a triglyceridů (TG), glukózy v plazmě V plazmě budou pomocí automatického analyzátoru stanoveny hladiny vysoce citlivého C-reaktivního proteinu, LPa, kortizolu, fibrinogenu a homocysteinu. Pacienti s glykémií nalačno > 126 mg/dl, užívající antidiabetickou medikaci nebo s předchozí diagnózou diabetu budou označeni jako diabetes mellitus 2. typu v souladu s diagnostickými kritérii American Diabetes Association. Hypercholesterolémie bude definována jako hladina celkového cholesterolu v séru > 200 mg/dl nebo použití látek snižujících lipidy podle pokynů panelu III pro léčbu dospělých v rámci Národního vzdělávacího programu pro vzdělávání dospělých.
2. Hematologická studie: hemogram a profil krevních buněk ve vzorcích plné krve.
3. Cirkulující prozánětlivé markery: cirkulující hladiny více zánětlivých cytokinů včetně IL-1p a IL-18 budou analyzovány komerčním multiplexním kitem (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Kromě toho budou hladiny proteinu aktivní kaspázy-1 a genové exprese Nlrp3 (CIAS1) a kaspázy-1 stanoveny v izolovaných PBMC pomocí Western-Blotting a RT-PCR, v daném pořadí, za účelem vyhodnocení aktivity zánětu.
4. Autofagické markery: Hladiny MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 a B a D katepsinů budou stanoveny metodou Western-Blotting v izolovaných izolátech proteinu PBMC. Exprese genu Beclin-1, y Maplc3 budou stanoveny pomocí RT-PCR v izolovaných PBMC s použitím beta-aktinu jako provozního genu.
5. Markery oxidačního stresu a antioxidační kapacita: poškození lipidů bude analyzováno stanovením 15-F2 isoprostanů v moči, poškození proteinů stanovením karbonylových proteinů v plazmě68 a poškození DNA stanovením 8-hydroxyguanosinu (8OHdG) v moči. . Kromě toho bude stanovení redoxního stavu in situ prováděno u subjektů na klinice pomocí kapky krve z prstu. Bude prováděna prostřednictvím systému Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA), který rovněž měří antioxidační kapacitu vzorku. Jedná se o nový systém, který spolehlivě měří celkový redoxní náboj v biologických vzorcích a také jejich antioxidační kapacitu.
6. Metabolomická studie: k provedení těchto analýz jsou nejprve extrahovány metabolity různých vzorků. Poté se molekuly přítomné v methanolovém extraktu oddělí chromatografií. Eluát je monitorován v systému ESI-Q-TOF-MS/MS elektrosprejem98. Analýza výsledků bude provedena ve spolupráci s Dr. Reinaldem Pamplonou z University of Lleida, se kterým na této problematice spolupracujeme již léta a s nímž sdílíme řadu výzkumů a publikací o metabolomice.

F) Studie parodontální mikroflóry. Vzorky subgingiválního plaku budou odebrány ze tří míst s nejvyššími PPD přiložením špičky filtračního papíru na periodontální kapsu během 30 s po izolaci zóny.

Vzorky subgingiválního plaku odebrané do suchých papírů budou analyzovány pomocí PCR za účelem vyhodnocení přítomnosti známých peridontopatogenů: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Studie mikroflóry budou prováděny pomocí technik hmotnostního sekvenování 16S rDNA. Sekvenování a bioinformatickou analýzu provede Integrated Microbiome Resource z University of Dalhousie v Kanadě.

G) Stanovení v moči.

Bude odebrána moč nalačno a budou provedena následující stanovení:

1. Markery oxidačního poškození: 8-hydroxy-2-deoxyguanosin a celkové F2-isoprostany budou měřeny v moči kompetitivní enzymovou imunoanalýzou. Výsledky budou normalizovány na hladinu kreatininu v moči.
2. Koncentrace metabolitů oleuropeinu: budou kvantifikovány pomocí LC-ESI-MS/MS jako v předchozích studiích.

H) Výpočet indexu úspěšného stárnutí K hodnocení stárnutí účastníků studie bude použit index úspěšného stárnutí (SAI), s potenciálním skóre v rozmezí od 0 do 10. Úplný index zahrnuje vzdělání, finanční postavení, fyzickou aktivitu, BMI, skóre GDS, účast na společenských aktivitách s přáteli, s rodinou, roční exkurze, skóre rizikových faktorů KVO a úroveň dodržování středomořské stravy pro vytvoření indexu. Bude vyvinuta kumulativní proměnná (rozmezí 0-4) udávající celkovou zátěž rizikovými faktory klasického kardiovaskulárního onemocnění (tj. obezita a anamnéza hypertenze, cukrovky a hypercholesterolémie) (účastníci, kteří nemají žádný z výše uvedených rizikových faktorů, obdrží skóre 0, mající skóre jednoho faktoru 1 atd.).

I) Kritéria úspěšnosti intervence Pro posouzení úspěšnosti intervence s oleuropeinem se jako hlavní proměnná považuje snížení hloubky sondování (PD) o 1 mm nebo více. Kromě toho, jako sekundární kritérium úspěchu, bude přijato snížení úrovně připojení o 1 mm nebo více a také snížení gingiválního krvácení při sondování o více než 20 %.

J) Statistická analýza Bude provedena deskriptivní analýza hlavních studovaných proměnných. U normálních kvantitativních proměnných se vypočítá průměr a směrodatná odchylka, v případě nenormálnosti medián a percentily. Kvalitativní proměnné budou vyjádřeny pomocí absolutních a relativních četností. Normalita proměnných bude kontrolována pomocí Kolmogorov-Smirnovova testu, aby bylo možné určit nutnost provedení transformací (logaritmických a dalších) před provedením srovnávacích studií. Ke studiu účinku léčby na různé proměnné ve stejné skupině bude použit Studentův t-test pro příbuzné vzorky. Pro provedení srovnávacích analýz ve stejnou dobu mezi oběma experimentálními skupinami bude použit Studentův t-test pro nezávislé vzorky.