Trattamento coadiuvante nei pazienti anziani con parodontite attraverso la somministrazione di un integratore ricco di oleuropeina dalla foglia di olivo (OLIVAGING)

Per calcolare la dimensione del campione, lo strumento GRANMO (https://www.imim.es/ofertadeserveis/software-public/granmo/) è stato utilizzato, considerando un rischio alfa di 0,05, un contrasto bilaterale, un rischio beta di 0,20, una deviazione standard delle differenze di 2,5, una differenza minima di 1 mm di riduzione della profondità di sondaggio da rilevare tra il basale e la fine dello studio, e una proporzione prevista di perdita del 20% di monitoraggio.

Trattamenti Tutti i pazienti riceveranno un esame orale completo al basale e dopo 4 mesi dopo il trattamento. La terapia iniziale verrà eseguita in tutti i pazienti e consisterà nell'ablazione completa della bocca e nella pianificazione radicolare a mano e con strumentazione a ultrasuoni, se necessario. Questo trattamento sarà completato con le istruzioni per l'igiene orale. Tutte le procedure terapeutiche iniziali saranno eseguite dallo stesso parodontologo.

Dopo il trattamento parodontale, i volontari arruolati verranno assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi da un secondo parodontologo. Il gruppo di controllo riceverà capsule di gelatina dura contenenti placebo (solo gli eccipienti), mentre il gruppo sperimentale riceverà le stesse capsule di gelatina dura ma contenenti 200 mg di un estratto di foglie di olivo. La randomizzazione verrà effettuata mediante l'uso di grafici a numeri casuali (mediante lancio di una moneta), che verranno eseguiti al momento dell'iscrizione del primo soggetto, e il soggetto successivo verrà assegnato all'altro gruppo in base all'assegnazione del primo soggetto. Sia il placebo che le capsule verranno dispensati dalla stessa persona e ai soggetti verranno fornite istruzioni verbali e scritte sul suo utilizzo. Man mano che i volontari verranno arruolati, verranno assegnati numeri di studio sequenziali e forniti delle loro capsule, sufficienti per un mese. I soggetti verranno alla Facoltà ogni 4 settimane durante il corso della sperimentazione per rifornire le loro capsule. L'assunzione delle capsule durerà per un totale di 4 mesi. I farmaci rimanenti saranno controllati per verificarne la conformità. Le capsule saranno preparate presso il CIDAF (Centro de Investigación Sobre Alimentos Funcionales) presso il Technological Health Park di Granada. L'estratto di oliva sarà ottenuto dall'azienda Natac (Madrid, España).

Raccolta e analisi dei campioni Tutta la raccolta e le determinazioni dei dati verranno eseguite al basale e dopo 4 mesi.

A) Esami orali Le misurazioni cliniche parodontali includeranno la presenza o l'assenza di placca dentale sopragengivale e sanguinamento gengivale al sondaggio (BOP), nonché profondità di sondaggio parodontale (PPD) e recessione del margine gengivale (GM). I parametri saranno misurati in sei siti (mesiobuccale, buccale, distobuccale, distolinguale, linguale e mesiolinguale) su ogni dente per mezzo di una sonda parodontale calibrata (Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA), 15 mm di lunghezza e 0,35 mm di diametro. Il livello di attacco clinico (CAL) verrà calcolato aggiungendo la recessione al PDD. Verrà registrato anche il numero di denti rimanenti. Verranno inoltre calcolati l'indice di placca di O´Leary e l'indice di sanguinamento di Van der Velden. I pazienti con sede BOP <10%, PPD ≤3 mm, assenza di eritema ed edema saranno considerati soggetti parodontalmente sani.

B) Raccolta dati sociodemografici

1. Dati sociodemografici di base: includeranno età, sesso, anni di istruzione.
2. Stato finanziario: ai partecipanti verrà chiesto di riportare il loro reddito medio durante i tre anni precedenti utilizzando una scala a quattro punti (basso, inadeguato a coprire le spese quotidiane = 1, medio, cercando di coprire le spese quotidiane = 2, buono, adeguato a coprire spese giornaliere = 3, molto buono, molto adeguato a coprire le spese giornaliere = 4).
3. Stato di fumatore: i fumatori attuali saranno definiti fumatori al momento del colloquio. Gli ex fumatori saranno definiti come coloro che avevano fumato in precedenza, ma non lo facevano da un anno o più. I restanti partecipanti saranno definiti fumatori occasionali o non correnti.
4. Livello di attività fisica: sarà valutato in minuti equivalenti metabolici (MET) a settimana, utilizzando il questionario internazionale sull'attività fisica (IPAQ) auto-riferito. Coloro che hanno riportato almeno 3 minuti MET a settimana saranno classificati come fisicamente attivi (minimamente attivi o "attività fisica che migliora la salute (HEPA) attiva"). Tutti gli altri saranno definiti fisicamente inattivi. Inoltre, verrà registrata la frequenza settimanale dell'attività fisica.
5. Sintomi della depressione del mese scorso: saranno valutati utilizzando una scala di depressione geriatrica (GDS) abbreviata e convalidata (range 0-20). Un punteggio GDS compreso tra 0 e 4 verrà utilizzato per indicare l'assenza di depressione, mentre i punteggi di 5-10 e N 10 indicheranno rispettivamente depressione lieve e grave.
6. Uso sanitario: verrà registrata la presenza di studi medici privati, centri sanitari pubblici o privati ​​o ospedali nel territorio di residenza, nonché il numero annuo di visite per il controllo periodico dello stato di salute.
7. Partecipazione sociale degli adulti: la frequenza settimanale delle loro attività sociali con la famiglia, i loro amici e la loro frequenza annuale delle escursioni saranno registrate a questo scopo.

C) Caratteristiche antropometriche e pressione arteriosa

1. Verranno misurati peso, altezza e circonferenza vita. Verranno calcolati l'IMC e il rapporto vita-fianchi. Il sovrappeso sarà definito come BMI compreso tra 25,0 e 29,9 kg/m2, mentre l'obesità sarà definita come BMI >29,9 kg/m2.
2. Pressione sanguigna: i pazienti con livelli di pressione sanguigna> 140/90 mmHg o che utilizzano farmaci antipertensivi saranno classificati come ipertesi.

D) Valutazione delle abitudini alimentari La valutazione delle abitudini alimentari si baserà su un questionario semi-quantitativo sulla frequenza alimentare (FFQ). FFQ sarà utilizzato per valutare il livello di aderenza alla dieta mediterranea, è stato utilizzato il MedDietScore (intervallo teorico 0-55).

E) Prelievo e analisi del sangue I campioni di sangue (16 mL) saranno prelevati mediante venipuntura dell'avambraccio dopo 12 ore di digiuno notturno, senza stasi in posizione seduta. I campioni di sangue intero saranno utilizzati per le valutazioni ematologiche. La maggior parte del sangue sarà aspirata in provette contenenti EDTA (1 mg/ml) e il plasma sarà isolato mediante centrifugazione a 1000 xg, per 10 min e diviso in aliquote di 250 μl per l'analisi immediata o per la conservazione a -80 °C . Il sangue verrà utilizzato anche per ottenere cellule mononucleate del sangue isolate (BMC) per altre analisi aggiuntive. Le aliquote contenenti entrambi, plasma o BMC, saranno conservate a -80º C fino all'analisi.

Le analisi del sangue saranno le seguenti:

1. Valutazioni biochimiche: livelli di lipidi nel sangue a digiuno (compresi colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL), colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL), colesterolo LDL diretto, colesterolo a bassissima densità (VLDL) e trigliceridi (TG), glucosio plasmatico , i livelli di proteina C-reattiva ad alta sensibilità, LPa, cortisolo, fibrinogeno e omocisteina saranno determinati nel plasma utilizzando un analizzatore automatico. I pazienti che mostrano una glicemia a digiuno > 126 mg/dL, che assumono farmaci antidiabetici o con una precedente diagnosi di diabete saranno determinati come diabete mellito di tipo 2 secondo i criteri diagnostici dell'American Diabetes Association. L'ipercolesterolemia sarà definita come livelli di colesterolo sierico totale> 200 mg / dL o uso di agenti ipolipemizzanti, secondo le linee guida del National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III.
2. Studio ematologico: emogramma e profilo ematico in campioni di sangue intero.
3. Marcatori pro-infiammatori circolanti: i livelli circolanti di più citochine infiammatorie tra cui IL-1β e IL-18 saranno analizzati da un kit multiplex commerciale (Cytokine Panel 1B 25plex, Thermo Fisher Scientific). Inoltre, i livelli proteici della caspasi-1 attiva e l'espressione genica di Nlrp3 (CIAS1) e caspasi-1 saranno determinati in PBMC isolate mediante Western-Blotting e RT-PCR, rispettivamente, per valutare l'attività dell'inflammasoma.
4. Marcatori autofagici: i livelli di catepsine MAP-LC3, ATG12, p62, TFEB, Beclin-1 e B e D saranno determinati mediante Western-Blotting in isolati proteici di PBMC. L'espressione genica di Beclin-1, y Maplc3 sarà determinata mediante RT-PCR in PBMC isolate utilizzando la beta-actina come gene housekeeper.
5. Marcatori di stress ossidativo e capacità antiossidante: verrà analizzato il danno ai lipidi attraverso la determinazione nelle urine degli isoprostani 15-F2, il danno alle proteine ​​mediante la determinazione delle proteine ​​carboniliche nel plasma68 e il danno al DNA attraverso la determinazione nelle urine dell'8-idrossiguanosina (8OHdG) . Inoltre, la determinazione dello stato redox in situ verrà eseguita nei soggetti presso la clinica utilizzando una goccia di sangue prelevata da un dito. Sarà effettuato attraverso il sistema Redoxsys (Aytu BioScience, Inc., Englewood, USA), che misura anche la capacità antiossidante del campione. Questo è un nuovo sistema che misura con un'affidabilità prima non disponibile la carica redox totale nei campioni biologici così come la capacità antiossidante di essi.
6. Studio metabolomico: per eseguire queste analisi, vengono prima estratti i metaboliti dei diversi campioni. Quindi le molecole presenti nell'estratto metanolico vengono separate mediante cromatografia. L'eluato viene monitorato in un sistema ESI-Q-TOF-MS/MS mediante elettrospray98. L'analisi dei risultati sarà effettuata in collaborazione con il Dr. Reinald Pamplona, ​​dell'Università di Lleida, con il quale collaboriamo da anni su questo tema e con il quale condividiamo una linea di ricerca e pubblicazioni sulla metabolomica.

F) Studio del microbiota parodontale. Campioni di placca sottogengivale saranno raccolti dai tre siti con i PPD più alti mettendo sulla tasca parodontale la punta di una carta da filtro per 30 s dopo aver isolato la zona.

Campioni di placca sottogengivale raccolti in carta secca saranno analizzati mediante PCR per valutare la presenza di peridontopatogeni noti: Phorphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum. Gli studi sul microbiota saranno condotti utilizzando tecniche di sequenziamento di massa del 16S rDNA. Il sequenziamento e l'analisi bioinformatica saranno eseguiti dall'Integrated Microbiome Resource, dell'Università di Dalhousie, in Canada.

G) Determinazioni nelle urine.

Verranno raccolte le urine a digiuno e verranno eseguite le seguenti determinazioni:

1. Marcatori di danno ossidativo: l'8-idrossi-2-deossiguanosina e gli F2-isoprostani totali saranno misurati nelle urine mediante immunodosaggio enzimatico competitivo. I risultati saranno normalizzati alla creatinina urinaria.
2. Concentrazione dei metaboliti dell'oleuropeina: saranno quantificati mediante LC-ESI-MS/MS come negli studi precedenti.

H) Calcolo dell'indice di invecchiamento di successo L'indice di invecchiamento di successo (SAI), con punteggi potenziali compresi tra 0 e 10, sarà impiegato per valutare l'invecchiamento dei partecipanti allo studio. L'indice completo comprende istruzione, stato finanziario, attività fisica, indice di massa corporea, punteggio GDS, partecipazione ad attività sociali con gli amici, con la famiglia, escursioni annuali, punteggio dei fattori di rischio CVD e livello di aderenza alla dieta mediterranea per sviluppare l'indice. Verrà sviluppata una variabile cumulativa (intervallo 0-4) che indica il carico complessivo dei classici fattori di rischio di malattie cardiovascolari (ad es. obesità e storia di ipertensione, diabete e ipercolesterolemia) (i partecipanti che non hanno nessuno dei suddetti fattori di rischio riceveranno punteggio 0, un fattore punteggio 1, ecc.).

I) Criteri di successo dell'intervento Per valutare il successo dell'intervento con oleuropeina, la riduzione di 1 mm o più della profondità di sondaggio (PD) sarà presa come variabile principale. Inoltre, e come criterio secondario di successo, verrà presa in considerazione una riduzione di 1 mm o più del livello di attacco, nonché una riduzione di oltre il 20% del sanguinamento gengivale al sondaggio.

J) Analisi statistica Verrà effettuata un'analisi descrittiva delle principali variabili studiate. Per le variabili quantitative normali si calcoleranno la media e la deviazione standard, o la mediana ei percentili nel caso di non normalità. Le variabili qualitative saranno espresse utilizzando frequenze assolute e relative. La normalità delle variabili sarà verificata con il test di Kolmogorov-Smirnov al fine di determinare la necessità di effettuare trasformazioni (logaritmiche ed altre) prima di effettuare gli studi di confronto. Per studiare l'effetto del trattamento sulle diverse variabili nello stesso gruppo, verrà utilizzato il test t di Student per campioni correlati. Per effettuare analisi comparative allo stesso tempo sperimentale tra i due gruppi sperimentali, verrà utilizzato il test t di Student per campioni indipendenti.