Proseq がん: 標的治療を求めて不治のがん患者のゲノム プロファイリング

患者はデンマーク北部地域から募集されます。 これは、社内の全エクソームシーケンス (WES) および RNA シーケンス (RNAseq) に基づく精密医療プログラムです。 対象となるすべての患者には、デンマークの GDPR 要件を満たしながら、バイオバンキング、臨床および検査データの登録、研究目的でのゲノムデータの共有を可能にする承認されたプロトコルへの登録が提供されます。

インフォームドコンセントの後、臨床病理学的ベースラインデータが腫瘍学の研究者によって登録されます。 新しい病理学的および分子的評価の結果は、国家分子腫瘍委員会 (NTB) で決定されるだけでなく、前向きに登録されます。

新しい 1.2 mm コアの針生検は、通常は超音波によってガイドされ、最も容易にアクセスでき、できれば照射されていない進行性の腫瘍病変から採取されます。 肺の中心部に位置する病変や合併症のリスクが高いその他の部位からの生検や、全身麻酔を必要とする処置は通常避けられます。 それぞれの場合において、1 つの生検は中性緩衝ホルマリンで固定され、組織病理学的評価に割り当てられます。 別の隣接する 1 ～ 2 個の生検は、分子分析のための処理が 5 日以内に行われるまで RNAlater に保管されます。 頭蓋内腫瘍を有する患者は、診断手術時またはその他の手術が必要な場合に生検され、臨床経過により患者がプロトコールの対象であることが示されるまで、組織は-80℃で凍結保存されます。 並行して、非腫瘍 DNA の分析のために 10 ml の EDTA 血液サンプルが採取されます。 未固定または新鮮な凍結組織材料が好ましい。 ただし、新しい生検が入手できず、新鮮な凍結組織が入手できない選択された患者では、腫瘍組織の最新の FFPE アーカイブ サンプルから DNA が抽出されます。 分析に組織が不十分な場合には、末梢血サンプルからの無細胞腫瘍 DNA (ctDNA) が使用されます。 ctDNA 分析用のサンプルは、無細胞 DNA 採血管 (Streck) に収集されます。

FFPE 腫瘍生検は、4 μm の 4 つのセクションと 1 μm のセクションに切断されます。 1 つの 4 µm 切片はヘマトキシリンおよびエオシンで染色され、もう 1 つは HER2 抗体で染色されます。 がんと組織学的サブタイプは上級コンサルタント病理学者によって診断されます。 免疫組織化学や標的NGSなどの追加の病理学的分析は、病理学者の主導により、または研究者や腫瘍委員会の要請に応じて、FFPE組織に対して行われます。

分子プロファイリングは社内で行われますが、他の施設で行われる場合もあります。 社内手順は次のとおりです。RNAlater 内の組織生検または新鮮な凍結組織がホモジナイズされ、Qiagen AllPrep® を使用して RNA と DNA が抽出されます。 プロファイリング用の非腫瘍 DNA は、QiaSymphony DSP DNA midi キット (Qiagen) を使用して末梢血白血球から抽出されます。 WES ライブラリの準備は、Sureselect XT HS ライブラリ準備キット (Agilent) を使用して実行されます。 エクソームのキャプチャは SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent) を使用して実行され、RNAseq ライブラリの調製は TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina) を使用して実行されます。 シーケンスは、NovaSeq 6000 (Illumina) で 2x150 bp ペアエンドとして実行され、腫瘍 DNA、非腫瘍 DNA、または腫瘍 RNA サンプルについて、それぞれ最小 26 Gb、18 Gb、または 3,300 万リードの生配列データが生成されます。 分子プロファイリングでは、腫瘍 DNA に対して、腫瘍/正常 WES 分析、コピー数変化の検出、TMB および MSI 状態の検出、および突然変異サイン分析を使用した体細胞短変異の検出が行われます。 腫瘍 RNA は、組織分類の入力として使用される発現プロファイルの生成に使用されます 26。 さらに、RNAseq により、より大きな染色体の略語を識別するための融合転写産物の検出が可能になります。 ctDNA は、QiaSymphony Virus/pathogen Midi Kit (Qiagen) を使用して、10 ml の血液サンプルから、またはまれに腹膜液から無細胞 DNA 採血管 (Streck) 内で抽出されます。 ライブラリーの調製には、TruSight Oncology 500 アッセイ (Illumina) を使用します。 2x150 bp ペアエンド シークエンシングは、NovaSeq 6000 (Illumina) で実行され、標的領域を最小 1500 倍カバーします。非腫瘍 DNA を使用して、少数の遺伝子セット (BRCA1、BRCA2、ATM、 MLH1、MSH2、MSH3、PMS1、MLH3、MSH6、PMS2、PALB2、RAD51C、RAD51D、MBD4、ANKRD26、CEBPA、DDX41、ETV6、GATA3、RUNX1、TERC、TERT、TP53）。 臨床遺伝学者による特別な要求と患者の同意がない限り、他の遺伝子の生殖系列変異は分析されません。 生の配列データは、地域の IT システムの下で処理され、保存されます。 配列データと補足メタデータはデンマーク国立ゲノムセンターに提出されます。 社内のバイオインフォマティクス手順は次のとおりです。 ゲノム解析ツール キット (GATK) を使用するプロセスは、主に GATK の推奨事項に従います。 フィルタリングされたバリアント ファイル (VCF) は、性別、年齢、診断、検出された融合転写産物、遺伝子の損失または増加に関する情報とともに、バリアントの自動分類のために Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) にアップロードされます。 臨床的に重要なバリアントはすべて、DNA および RNAseq データの目視検査によって手動で検証されます。 バリアントは、病原性、病原性の可能性が高い、重要性不明のバリアント (VUS)、または良性/良性の可能性があるとして分類されます。 QCI は、バリアントと承認された治療法または臨床試験を階層に結び付けるために前向きに使用されることもあります。 非腫瘍性バリアントは 2015 年の ACMG/AMP ガイドラインに従って分類され、患者の病歴とともに臨床遺伝学を専門とする医師によって検討されます。 患者または親族の健康に影響を与える可能性のある生殖細胞系列変異が特定された場合、プロトコルの同意を得てこの情報を要求した患者には、臨床遺伝学部門への紹介が提供されます。 レポートは、REDCap に保存された臨床データとバリアント データから専用プラットフォーム (PrOnco) を使用して生成されます。 このプラットフォームにより、腫瘍ボード レポートをオンデマンドで生成したり、対話型インターフェイスを通じてアクセスしたりできるようになります。

症例は、コペンハーゲンのリグショスピタレットのフェーズ I ユニットが指揮する毎週のウェブベースの学際的な NTB で発表されます。 患者の病歴と特徴、開示された分子変異体、遺伝子サインまたはその他の腫瘍の特徴、利用可能な治験または薬剤に基づいて、適合する治療法および初期臨床試験が提案されます。

国内で承認された適応症の標的薬剤が NTB によって提案された場合、その場で治療を提供できます。 そうでない場合、患者は利用可能な臨床プロトコルで治療される可能性があります。 これには特に、ProTarget 試験が含まれます。ProTarget 試験は、全国規模で研究者が開始する標的治療のバスケット試験であり、同様の標的、同様の薬剤、および同様の診断を受けた患者のコホートで「適応外」で使用される承認薬の有効性を研究するものです (NCT04341181)。 承認された薬剤や関連プロトコルが利用できない、または実行可能でない場合は、臨床プロトコル外で使用される標的薬剤による治療が追求されます。 これには、ラベルは貼られているもののデンマーク当局によって承認されていない薬剤による治療も含まれますが、個人の許可があれば使用できます。 これには、個人の許可を経た「適応外」治療や、「指定ユーザープログラム」における未承認薬の「寛容な使用」も含まれる。 臨床試験以外で適合する標的薬で治療を受けた患者は、ベースライン時と進行までの8週目または9週ごとにCTまたはMRスキャンとバイオマーカーによって評価される。 研究用の血液サンプルは採取され、デンマークのバイオアンドゲノムバンクに保管され、治療データは将来に向けて登録されます。