Proseq Cancer: Genominen profilointi potilailla, joilla on parantumaton syöpä kohdennettua hoitoa etsimässä

Potilaat rekrytoidaan Pohjois-Tanskan alueelta. Tämä on tarkkuuslääketieteellinen ohjelma, joka perustuu yrityksen sisäiseen koko eksomin sekvensointiin (WES) ja RNA-sekvensointiin (RNAseq). Kaikille kelvollisille potilaille tarjotaan ilmoittautumista hyväksyttyyn protokollaan, joka mahdollistaa biopankkitoiminnan, kliinisen ja laboratoriotietojen rekisteröinnin sekä genomitietojen jakamisen tutkimustarkoituksiin täyttäen samalla Tanskan GDPR-vaatimukset.

Tietoisen suostumuksen jälkeen onkologiset tutkijat rekisteröivät kliinis-patologiset perustiedot. Uusien patologisten ja molekyylien arviointien tulokset rekisteröidään ja päätökset tehdään kansallisessa molekyylikasvainten lautakunnassa (NTB).

Uudet 1,2 mm:n ytimen neulabiopsiat otetaan helpoimmin saatavilla olevasta, mieluiten etenevästä kasvainleesiosta, jota ei ole säteilytetty, yleensä ultraäänen ohjaamana. Biopsiat keskeisesti sijaitsevista keuhkovaurioista tai muista kohdista, joissa on lisääntynyt komplikaatioiden riski, tai yleisanestesiaa vaativia toimenpiteitä yleensä vältetään. Kussakin tapauksessa yksi biopsia kiinnitetään neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja osoitetaan histopatologiseen arviointiin. Toinen, vierekkäinen 1-2 biopsiaa säilytetään RNAlaterissa, kunnes ne käsitellään molekyylianalyysiä varten 5 päivän sisällä. Potilailta, joilla on kallonsisäisiä kasvaimia, otetaan biopsia diagnostisen leikkauksen yhteydessä tai jos leikkausta muutoin tarvitaan, ja kudosta pidetään jäädytettynä -80 °C:ssa, kunnes kliininen kulku osoittaa, että potilaat ovat kelvollisia protokollaan. Samanaikaisesti otetaan 10 ml:n EDTA-verinäyte ei-tuumori-DNA:n analysointia varten. Kiinnittämätön tai tuore pakastettu pehmopaperi on edullinen. Kuitenkin valituilta potilailta, joille uutta biopsiaa ei saada eikä tuoretta pakastettua kudosta ole saatavilla, DNA uutetaan viimeisimmästä kasvainkudoksen FFPE-arkistonäytteestä. Solutonta kasvain-DNA:ta (ctDNA) perifeerisistä verinäytteistä käytetään tapauksissa, joissa kudosta ei ole riittävästi analysoitavaksi. Näytteet ctDNA-analyysiä varten kerätään soluttomiin DNA-verenkeräysputkiin (Streck).

FFPE-kasvainbiopsiat leikataan neljään osaan, joiden koko on 4 um ja yksi 1 um. Yksi 4 um:n leike värjätään hematoksyliinillä ja eosiinilla ja toinen HER2-vasta-aineella. Syövän ja histologisen alatyypin diagnosoivat johtavat patologit. Muita patologisia analyysejä, mukaan lukien immunohistokemia tai kohdennettu NGS, tehdään FFPE-kudokselle patologin aloitteesta tai tutkijoiden tai kasvainlautakunnan pyynnöstä.

Molekyyliprofilointi suoritetaan talon sisällä, mutta se voidaan suorittaa myös muissa paikoissa. Sisäinen menettely on seuraava: RNAlaterissa tai tuoreessa pakastekudoksessa otetut kudosbiopsiat homogenisoidaan ja RNA ja DNA uutetaan Qiagen AllPrep®:llä. Ei-kasvain-DNA profilointia varten uutetaan perifeerisen veren leukosyyteistä käyttämällä QiaSymphony DSP DNA midi kit (Qiagen). WES-kirjaston valmistelu suoritetaan käyttämällä Sureselect XT HS Library Prep Kits -pakkauksia (Agilent). Exome-kaappaus suoritetaan käyttämällä SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2:ta (Agilent), kun taas RNAseq-kirjaston valmistelu tehdään käyttämällä TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit -pakkausta (Illumina). Sekvensointi suoritetaan 2 x 150 emäsparin paripäässä NovaSeq 6000:lla (Illumina), joka tuottaa vähintään 26 Gb, 18 Gb tai 33 miljoonaa lukemaa raakasekvenssidataa kasvain-DNA-, ei-kasvain-DNA- tai kasvain-RNA-näytteille, vastaavasti. Molekyyliprofilointia varten tuumori-DNA:lle tehdään somaattinen lyhyt variantti havaitseminen käyttämällä kasvain/normaali WES-analyysiä, kopiolukumuutosten havaitseminen, TMB- ja MSI-status ja mutaatioiden allekirjoitusanalyysi. Kasvain-RNA:ta käytetään ekspressioprofiilin luomiseen, jota käytetään kudosten luokittelun syötteenä26. Lisäksi RNAseq mahdollistaa fuusiotranskriptien havaitsemisen suurempien kromosomilyhenteiden tunnistamiseksi. ctDNA uutetaan 10 ml:n verinäytteistä tai harvoissa tapauksissa vatsakalvon nesteestä soluttomissa DNA-verenkeräysputkissa (Streck) käyttämällä QiaSymphony Virus/patogen Midi Kitiä (Qiagen). Kirjaston valmistukseen käytetään TruSight Oncology 500 -määritystä (Illumina). 2x150 bp:n pariperäinen sekvensointi suoritetaan NovaSeq 6000 (Illumina) -laitteella, joka tuottaa vähintään 1500-kertaisen peiton kohdealueille. Ei-kasvain-DNA:ta käyttämällä havaitaan kliinisesti merkityksellisiä patogeenisiä variantteja pienestä geenijoukosta (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT ja TP53). Muiden geenien ituradan variantteja ei analysoida, elleivät kliiniset geneetikot ole erikseen pyytäneet ja potilas suostu siihen. Sekvensoinnin raakadata käsitellään ja tallennetaan alueellisen IT-järjestelmän alle. Sekvensointitiedot ja täydentävät metatiedot toimitetaan Tanskan kansalliselle genomikeskukselle. Talon sisäinen bioinformaattinen menettely on seuraava: Genome Analysis Tool Kit (GATK) avulla prosessi noudattaa suurelta osin GATK-suosituksia. Suodatettu varianttitiedosto (VCF) ladataan yhdessä sukupuolen, iän, diagnoosin ja havaittujen fuusiotranskriptien, geenien menetysten tai lisäysten kanssa Qiagen Clinical Insight Interpretiin (QCI) varianttien automaattista luokittelua varten. Kaikki kliinisesti merkittävät variantit varmistetaan manuaalisesti DNA- ja RNAseq-tietojen visuaalisella tarkastuksella. Variantit luokitellaan patogeenisiksi, todennäköisesti patogeenisiksi, tuntemattoman merkityksen varianteiksi (VUS) tai hyvänlaatuisiksi/todennäköisiksi hyvänlaatuisiksi. QCI:tä käytetään myös prospektiivisesti muunnelmien ja hyväksyttyjen hoitojen tai kliinisten kokeiden yhdistämiseen tasoiksi. Ei-tuumoraaliset variantit luokitellaan vuoden 2015 ACMG/AMP-ohjeiden mukaisesti, ja kliiniseen genetiikkaan erikoistunut lääkäri arvioi ne yhdessä potilaiden historian kanssa. Jos havaitaan ituradan muunnelma, jolla on todennäköinen vaikutus potilaan tai sukulaisen terveyteen, potilaille, jotka ovat pyytäneet tätä tietoa protokollan suostumuksella, tarjotaan lähete kliinisen genetiikan osastolle. Raportit luodaan käyttämällä erityistä alustaa (PrOnco) REDCapiin tallennetuista kliinisistä tiedoista ja muunnelmatiedoista. Alusta mahdollistaa kasvaintauluraportin generoinnin pyynnöstä tai saatavuuden interaktiivisen käyttöliittymän kautta.

Tapauksia esitellään viikoittain verkkopohjaisessa monitieteisessä NTB:ssä, jota johtaa Kööpenhaminan Rigshospitaletin vaihe I yksikkö. Potilaiden historian ja ominaisuuksien, julkistettujen molekyylivarianttien, geenien allekirjoitusten tai muiden kasvaimen ominaisuuksien ja saatavilla olevien kokeiden tai lääkkeiden, yhteensopivien hoitojen ja varhaisen vaiheen kliinisten kokeiden perusteella ehdotetaan.

Hoitoa voidaan tarjota paikan päällä, jos NTB ehdottaa kohdelääkettä kansallisesti hyväksyttyyn käyttöaiheeseen. Jos ei, potilasta voidaan hoitaa käytettävissä olevan kliinisen protokollan mukaisesti. Tämä sisältää erityisesti ProTarget-tutkimuksen – valtakunnallisen, tutkijan aloitteen kohdennetun hoidon koritutkimuksen, jossa tutkitaan hyväksyttyjen lääkkeiden tehokkuutta "off label" -potilasryhmissä, joilla on samanlainen kohde, samanlainen lääke ja samanlainen diagnoosi (NCT04341181). Jos hyväksyttyä lääkettä tai asiaankuuluvaa protokollaa ei ole saatavilla tai se ei ole mahdollista, hoitoa jatketaan kohdelääkkeellä, jota käytetään kliinisen protokollan ulkopuolella. Tämä sisältää hoidon lääkkeellä, joka on merkitty, mutta jota Tanskan viranomaiset eivät ole hyväksyneet, mutta sitä voidaan käyttää yksilöllisen luvan jälkeen. Se sisältää myös "off label" -hoidon yksilöllisen luvan jälkeen tai "myötätuntoisen käytön" hyväksymättömällä lääkkeellä "nimetyssä käyttäjäohjelmassa". Potilaat, joita hoidetaan sopivilla kohdistetuilla lääkkeillä kliinisen lääketutkimuksen ulkopuolella, arvioidaan CT- tai MR-skannauksilla ja biomarkkereilla lähtötilanteessa ja joka 8. tai 9. viikko etenemiseen asti. Verinäytteet tutkimusta varten otetaan ja säilytetään Tanskan Bio- ja Genome Bankissa, kun taas hoitotiedot rekisteröidään prospektiivisesti.