Proseq 암: 표적 치료를 위한 난치성 암 환자의 게놈 프로파일링

북덴마크 지역에서 환자를 모집합니다. 자체 개발한 WES(Whole exome sequencing)와 RNAseq(RNA sequencing) 기반 정밀의학 프로그램입니다. 자격이 있는 모든 환자는 덴마크 GDPR 요구 사항을 충족하면서 바이오뱅킹, 임상 및 실험실 데이터 등록, 연구 목적으로 게놈 데이터 공유를 허용하는 승인된 프로토콜에 등록할 수 있습니다.

정보에 입각한 동의를 얻은 후 종양학 조사관이 임상 병리학적 기준선 데이터를 등록합니다. 새로운 병리학적 및 분자적 평가의 결과는 국립 분자종양위원회(National Molecular Tumor Board, NTB)에서 내린 결정뿐만 아니라 전향적으로 등록됩니다.

새로운 1.2mm 코어 바늘 생검은 가장 쉽게 접근할 수 있고 바람직하게는 일반적으로 초음파에 의해 유도되는 조사되지 않은 진행성 종양 병변에서 채취됩니다. 중앙에 위치한 폐 병변 또는 합병증의 위험이 높은 다른 부위의 생검 또는 전신 마취가 필요한 절차는 일반적으로 피합니다. 각각의 경우에, 중성 완충 포르말린에 하나의 생검을 고정하고 조직병리학적 평가에 할당합니다. 또 다른 인접한 1-2 생검은 5일 이내에 분자 분석을 위해 처리될 때까지 RNAlater에 보관됩니다. 두개내 종양이 있는 환자는 진단 수술 시 또는 수술이 필요한 경우 생검을 하고 임상 과정에서 환자가 프로토콜에 적합하다고 표시될 때까지 조직을 -80°C에서 냉동 보관합니다. 동시에, 비종양 DNA 분석을 위해 10ml EDTA 혈액 샘플을 채취합니다. 고정되지 않거나 신선한 냉동 조직 재료가 선호됩니다. 그러나 새로운 생검을 얻을 수 없고 신선한 냉동 조직을 사용할 수 없는 선택된 환자의 경우 종양 조직의 가장 최근 FFPE 보관 샘플에서 DNA를 추출합니다. 말초 혈액 샘플의 무세포 종양 DNA(ctDNA)는 분석을 위한 조직이 부족한 경우에 사용됩니다. ctDNA 분석을 위한 샘플은 무세포 DNA 혈액 수집 튜브(Streck)에서 수집됩니다.

FFPE 종양 생검은 4 μm의 4개 섹션과 1 μm 중 하나로 절단됩니다. 하나의 4 µm 섹션은 헤마톡실린과 에오신으로 염색되고 다른 섹션은 HER2 항체로 염색됩니다. 암 및 조직학적 하위 유형은 수석 컨설턴트 병리학자에 의해 진단됩니다. 면역조직화학 또는 표적 NGS를 포함한 추가 병리학적 분석은 병리학자의 주도로 또는 조사자 또는 종양 위원회에서 요청하는 경우 FFPE 조직에서 수행됩니다.

분자 프로파일링은 사내에서 수행되지만 다른 사이트에서도 수행될 수 있습니다. 사내 절차는 다음과 같습니다. RNAlater 또는 신선한 냉동 조직의 조직 생검을 균질화하고 Qiagen AllPrep®을 사용하여 RNA와 DNA를 추출합니다. QiaSymphony DSP DNA midi 키트(Qiagen)를 사용하여 말초 혈액 백혈구에서 프로파일링을 위한 비종양 DNA를 추출합니다. WES 라이브러리 준비는 Sureselect XT HS 라이브러리 준비 키트(Agilent)를 사용하여 수행됩니다. Exome 캡처는 SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2(Agilent)를 사용하여 수행되는 반면, RNAseq 라이브러리 준비는 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit(Illumina)를 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱은 NovaSeq 6000(Illumina)에서 2x150bp 페어드 엔드로 수행되어 종양 DNA, 비종양 DNA 또는 종양 RNA 샘플에 대해 각각 최소 26Gb, 18Gb 또는 3300만 판독의 원시 시퀀스 데이터를 생성합니다. 분자 프로파일링을 위해 종양 DNA는 종양/정상 WES 분석, 카피 수 변경 검출, TMB 및 MSI 상태 및 돌연변이 서명 분석을 사용하여 체세포 짧은 변이체 검출을 받습니다. 종양 RNA는 조직 분류를 위한 입력으로 사용되는 발현 프로필 생성에 사용됩니다26. 더욱이, RNAseq는 더 큰 염색체 약어를 식별하기 위한 융합 전사체의 검출을 가능하게 합니다. ctDNA는 QiaSymphony 바이러스/병원체 Midi 키트(Qiagen)를 사용하여 무세포 DNA 혈액 수집 튜브(Streck)의 복막액 또는 10ml 혈액 샘플에서 추출됩니다. TruSight Oncology 500 분석(Illumina)은 라이브러리 준비에 사용됩니다. NovaSeq 6000(Illumina)에서 2x150 bp 페어드 엔드 시퀀싱을 수행하여 대상 영역의 최소 1500x 커버리지를 생성합니다. 비종양 DNA를 사용하여 임상적으로 관련된 병원성 변이체가 작은 유전자 세트(BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT 및 TP53). 임상 유전학자가 구체적으로 요청하고 환자가 동의하지 않는 한 다른 유전자의 생식계열 변이체는 분석되지 않습니다. 원시 시퀀싱 데이터는 지역 IT 시스템에서 처리 및 저장됩니다. 시퀀싱 데이터 및 보충 메타데이터는 덴마크 국립 게놈 센터에 제출됩니다. 사내 생물 정보 절차는 다음과 같습니다. 게놈 분석 도구 키트(GATK)를 사용하여 프로세스는 대체로 GATK 권장 사항을 따릅니다. 필터링된 변형 파일(VCF)은 성별, 연령, 진단 및 검출된 융합 전사체, 유전자 손실 또는 증가에 대한 정보와 함께 변형의 자동 분류를 위해 Qiagen Clinical Insight Interpret(QCI)에 업로드됩니다. 임상적으로 중요한 모든 변형은 DNA 및 RNAseq 데이터의 육안 검사를 통해 수동으로 확인됩니다. 변이체는 병원성, 병원성 가능성이 있는 변종, 의미를 알 수 없는 변종(VUS) 또는 양성/양성일 가능성이 있는 변종으로 분류됩니다. QCI는 또한 변형 및 승인된 치료 또는 임상 시험을 계층으로 연결하기 위해 전향적으로 사용됩니다. 비종양 변이체는 2015 ACMG/AMP 가이드라인에 따라 분류되며 환자 병력과 함께 임상 유전학 전문 MD가 검토합니다. 환자 또는 친척의 건강에 영향을 미칠 가능성이 있는 생식계열 변이가 확인되면 프로토콜 동의 시 이 정보를 요청한 환자에게 임상 유전학 부서로의 의뢰가 제공됩니다. 보고서는 REDCap에 저장된 임상 데이터와 변형 데이터에서 전용 플랫폼(PrOnco)을 사용하여 생성됩니다. 이 플랫폼을 사용하면 필요에 따라 종양 보드 보고서를 생성하거나 대화형 인터페이스를 통해 액세스할 수 있습니다.

사례는 코펜하겐 Rigshospitalet의 1단계 부서에서 감독하는 주간 웹 기반 다학제적 NTB에서 발표됩니다. 환자의 병력 및 특성에 기초하여 공개된 분자 변이체, 유전자 서명 또는 기타 종양 특성 및 이용 가능한 시험 또는 약물, 일치된 치료법 및 초기 단계 임상 시험이 제안됩니다.

NTB에서 국가적으로 승인된 적응증의 표적 약물을 제안하는 경우 현장에서 치료가 제공될 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 환자는 사용 가능한 임상 프로토콜로 치료될 수 있습니다. 여기에는 특히 유사한 표적, 유사한 약물 및 유사한 진단(NCT04341181)을 가진 환자 코호트에서 "오프 라벨"로 사용된 승인된 약물의 효능을 연구하는 표적 치료에 대한 전국적인 연구자 주도 바스켓 시험인 ProTarget 시험이 포함됩니다. 승인된 약물이나 관련 프로토콜이 없거나 실행 가능한 경우 임상 프로토콜 외부에서 사용되는 표적 약물로 치료를 추구합니다. 여기에는 라벨이 붙어 있지만 덴마크 당국의 승인을 받지 않은 약물을 사용한 치료가 포함되지만 개별 허가 후에 사용할 수 있습니다. 또한 개별 허가 후 "오프 라벨" 치료 또는 "지명된 사용자 프로그램"에서 승인되지 않은 약물의 "자비로운 사용"도 포함됩니다. 임상 약물 시험 외부에서 일치하는 표적 약물로 치료받은 환자는 기준선에서 그리고 진행될 때까지 8주 또는 9주마다 CT 또는 MR 스캔 및 바이오마커로 평가됩니다. 연구용 혈액 샘플을 채취하여 덴마크 바이오 및 게놈 은행에 보관하고 치료 데이터는 전향적으로 등록합니다.