Proseq Cancer: Genomisk profilering hos pasienter med uhelbredelig kreft på jakt etter målrettet behandling

Pasienter rekrutteres fra Region Nordjylland. Dette er et presisjonsmedisinprogram basert på intern heleksomesekvensering (WES) og RNA-sekvensering (RNAseq). Alle kvalifiserte pasienter tilbys påmelding i en godkjent protokoll, som tillater biobanking, registrering av kliniske data og laboratoriedata og deling av genomiske data med forskningsformål, samtidig som de oppfyller de danske GDPR-kravene.

Etter informert samtykke registreres klinisk-patologiske baselinedata av onkologiske etterforskere. Resultater av nye patologiske og molekylære vurderinger blir prospektivt registrert samt vedtak fattet i Nasjonalt molekylærtumorstyre (NTB).

Nye 1,2 mm kjernenålsbiopsier tas fra den lettest tilgjengelige, fortrinnsvis progredierende tumorlesjon som ikke er bestrålt, vanligvis ledet av ultralyd. Biopsier fra sentralt plasserte lungelesjoner eller andre steder med økt risiko for komplikasjoner, eller prosedyrer som krever generell anestesi, unngås generelt. I hvert tilfelle fikseres én biopsi i nøytralbufret formalin og allokeres til histopatologisk vurdering. En annen, tilstøtende 1-2 biopsier holdes i RNAlater til behandling for molekylær analyse innen 5 dager. Pasienter med intrakranielle svulster blir biopsiert på tidspunktet for diagnostisk kirurgi eller hvis kirurgi er nødvendig på annen måte, og vev oppbevares frosset ved -80 °C inntil det kliniske forløpet indikerer at pasientene er kvalifisert for protokollen. Parallelt tas det en 10 ml EDTA-blodprøve for analyse av ikke-tumoralt DNA. Ufiksert eller ferskfrosset vevmateriale foretrekkes. Hos utvalgte pasienter hvor det ikke er mulig å få en ny biopsi og ikke noe ferskt frossent vev er tilgjengelig, ekstraheres DNA fra den nyeste FFPE-arkivprøven av tumorvev. Cellefritt tumor-DNA (ctDNA) fra perifere blodprøver brukes i tilfeller med utilstrekkelig vev for analyse. Prøver for ctDNA-analyse samles i cellefrie DNA-blodprøverør (Streck).

FFPE-tumorbiopsiene kuttes i fire seksjoner på 4 µm og en på 1 µm. En 4 µm seksjon er farget med hematoxylin og eosin og en annen med HER2-antistoff. Kreft og histologisk subtype er diagnostisert av seniorkonsulent patologer. Ytterligere patologiske analyser, inkludert immunhistokjemi eller målrettet NGS, gjøres på FFPE-vev på initiativ fra patologen, eller hvis etterforskere eller tumorstyret ber om det.

Den molekylære profileringen utføres internt, men kan også utføres på andre steder. Den interne prosedyren er som følger: Vevsbiopsier i RNAlater eller ferskfrosset vev homogeniseres, og RNA og DNA ekstraheres med Qiagen AllPrep®. Ikke-tumoralt DNA for profilering ekstraheres fra perifere blodleukocytter ved hjelp av QiaSymphony DSP DNA midi kit (Qiagen). Forberedelse av WES-biblioteket utføres ved å bruke Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Eksomefangst utføres ved hjelp av SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), mens RNAseq-biblioteksforberedelse gjøres ved å bruke TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Sekvensering utføres som 2x150 bp paret ende på en NovaSeq 6000 (Illumina), og produserer minimum 26 Gb, 18 Gb eller 33 millioner avlesninger av råsekvensdata for henholdsvis tumor-DNA, ikke-tumoralt DNA eller tumor-RNA-prøver. For molekylær profilering blir tumor-DNA utsatt for somatisk kortvariantdeteksjon ved bruk av tumor/normal WES-analyse, påvisning av kopiantallsendringer, TMB- og MSI-status og mutasjonssignaturanalyse. Tumor-RNA brukes til å generere en ekspresjonsprofil som brukes som input for vevsklassifisering26. Dessuten muliggjør RNAseq deteksjon av fusjonstranskripsjoner for identifikasjon av større kromosomale forkortelser. ctDNA ekstraheres fra 10 ml blodprøver eller, i noen få tilfeller, fra peritonealvæske i cellefrie DNA-blodprøverør (Streck) ved bruk av QiaSymphony Virus/patogen Midi Kit (Qiagen). TruSight Oncology 500-analyse (Illumina) brukes til biblioteksforberedelse. 2x150 bp sekvensering med paret ende utføres på en NovaSeq 6000 (Illumina) som produserer minimum 1500x dekning av målregionene. Ved å bruke ikke-tumoralt DNA, oppdages klinisk relevante patogene varianter i et lite sett med gener (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT og TP53). Kimlinjevarianter i andre gener analyseres ikke, med mindre det er spesifikt forespurt av kliniske genetikere og samtykke fra pasienten. Rå sekvenseringsdata behandles og lagres under det regionale IT-systemet. Sekvenseringsdata og supplerende metadata sendes til Danish National Genome Center. Den interne bioinformatiske prosedyren er som følger: Ved å bruke Genome Analysis Tool Kit (GATK) følger prosessen stort sett GATK-anbefalingene. Den filtrerte variantfilen (VCF) lastes opp sammen med informasjon om kjønn, alder, diagnose og påviste fusjonstranskripsjoner, gentap eller gevinster, til Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) for automatisk klassifisering av varianter. Alle varianter av klinisk betydning verifiseres manuelt ved visuell inspeksjon av DNA- og RNAseq-dataene. Varianter er klassifisert som patogene, sannsynlig patogene, varianter av ukjent betydning (VUS), eller godartede/sannsynligvis godartede. QCI brukes også prospektivt for å koble varianter og godkjente behandlinger eller kliniske studier i nivåer. Ikke-tumorale varianter er klassifisert i henhold til 2015 ACMG/AMP-retningslinjene og er, sammen med pasienthistorien, gjennomgått av en lege som er spesialisert i klinisk genetikk. Hvis en kimlinjevariant med sannsynlig konsekvens for helsen til pasienten eller en pårørende identifiseres, tilbys pasienter som hadde bedt om denne informasjonen ved protokollsamtykke, henvisning til avdeling for klinisk genetikk. Rapporter genereres ved hjelp av en dedikert plattform (Pronco) fra kliniske data lagret i REDCap og variantdata. Plattformen gjør det mulig å generere en tumortavlerapport på forespørsel eller gjøres tilgjengelig via et interaktivt grensesnitt.

Saker presenteres ved en ukentlig nettbasert flerfaglig NTB, ledet av fase I-enheten ved Rigshospitalet, København. Basert på pasientenes historie og egenskaper, avslørte molekylære varianter, gensignaturer eller andre tumorkarakteristikker og tilgjengelige studier eller legemidler, foreslås matchede behandlinger og kliniske studier i tidlig fase.

Behandling kan tilbys på stedet dersom et målrettet legemiddel med nasjonalt godkjent indikasjon foreslås av NTB. Hvis ikke, kan pasienten bli behandlet i en tilgjengelig klinisk protokoll. Dette inkluderer spesielt ProTarget-studien - en landsomfattende, etterforsker-initiert kurvstudie av målrettet behandling, som studerer effekten av godkjente legemidler brukt "off label" i kohorter av pasienter med lignende mål, lignende legemiddel og lignende diagnose (NCT04341181). Hvis ingen godkjent legemiddel eller relevant protokoll er tilgjengelig eller mulig, fortsettes behandling med et målrettet legemiddel brukt utenfor en klinisk protokoll. Dette inkluderer behandling med et legemiddel som er merket, men ikke godkjent av danske myndigheter, men kan brukes etter individuell tillatelse. Det inkluderer også "off label"-behandling etter individuell tillatelse, eller "medfølende bruk" med et ikke-godkjent stoff i et "navngitt brukerprogram". Pasienter behandlet med matchede målrettede legemidler utenfor en klinisk legemiddelutprøving blir evaluert med CT- eller MR-skanning og biomarkører ved baseline og hver 8. eller 9. uke frem til progresjon. Blodprøver for forskning tas og lagres i Bio- og Genom Bank Danmark, mens behandlingsdata registreres prospektivt.