Rak Proseq: profilowanie genomowe u pacjentów z nieuleczalnym rakiem w poszukiwaniu ukierunkowanego leczenia

Pacjenci są rekrutowani z Regionu Północnej Danii. Jest to program medycyny precyzyjnej oparty na wewnętrznym sekwencjonowaniu całego egzomu (WES) i sekwencjonowaniu RNA (RNAseq). Wszystkim kwalifikującym się pacjentom oferujemy zapisanie się do zatwierdzonego protokołu, który umożliwia biobankowanie, rejestrację danych klinicznych i laboratoryjnych oraz udostępnianie danych genomicznych do celów badawczych, przy jednoczesnym spełnieniu wymogów duńskiego RODO.

Po uzyskaniu świadomej zgody podstawowe dane kliniczno-patologiczne są rejestrowane przez badaczy onkologicznych. Wyniki nowych ocen patologicznych i molekularnych są prospektywnie rejestrowane, podobnie jak decyzje podejmowane w Krajowej Radzie ds. Nowotworów Molekularnych (NTB).

Nowe biopsje gruboigłowe 1,2 mm pobiera się z najłatwiej dostępnej, najlepiej postępującej zmiany nowotworowej, która nie była napromieniowana, zwykle pod kontrolą USG. Na ogół unika się biopsji ze zmian centralnie położonych w płucach lub innych miejsc o zwiększonym ryzyku powikłań lub zabiegów wymagających znieczulenia ogólnego. W każdym przypadku jedna biopsja jest utrwalana w obojętnie buforowanej formalinie i poddawana ocenie histopatologicznej. Kolejne, sąsiednie 1-2 biopsje są przechowywane w RNA później do czasu przetworzenia do analizy molekularnej w ciągu 5 dni. Pacjenci z guzami wewnątrzczaszkowymi są poddawani biopsji w czasie operacji diagnostycznej lub jeśli operacja jest wymagana z innego powodu, a tkankę przechowuje się w stanie zamrożenia w temperaturze -80°C do czasu, gdy przebieg kliniczny wykaże, że pacjenci kwalifikują się do protokołu. Równolegle pobiera się 10 ml próbki krwi z EDTA do analizy nienowotworowego DNA. Preferowany jest nieutrwalony lub świeżo zamrożony materiał tkankowy. Jednak u wybranych pacjentów, u których nowa biopsja jest niedostępna i nie jest dostępna świeżo zamrożona tkanka, DNA jest ekstrahowane z najnowszej archiwalnej próbki tkanki nowotworowej FFPE. Wolne od komórek DNA guza (ctDNA) z próbek krwi obwodowej jest stosowane w przypadkach, gdy tkanka jest niewystarczająca do analizy. Próbki do analizy ctDNA są pobierane do wolnych od komórek probówek do pobierania krwi DNA (Streck).

Biopsje guza FFPE pocięto na cztery skrawki o grubości 4 µm i jedno o grubości 1 µm. Jeden skrawek 4 µm barwi się hematoksyliną i eozyną, a drugi przeciwciałem HER2. Rak i podtyp histologiczny są diagnozowane przez starszych konsultantów patologów. Dodatkowe analizy patologiczne, w tym immunohistochemiczne lub ukierunkowane NGS, są wykonywane na tkance FFPE z inicjatywy patologa lub na żądanie badaczy lub rady ds. guzów.

Profilowanie molekularne przeprowadza się na miejscu, ale można je również przeprowadzić w innych miejscach. Procedura wewnętrzna jest następująca: Biopsje tkanek w RNAlater lub świeżo zamrożonej tkance są homogenizowane, a RNA i DNA ekstrahowane przy użyciu Qiagen AllPrep®. Nienowotworowe DNA do profilowania ekstrahuje się z leukocytów krwi obwodowej przy użyciu zestawu QiaSymphony DSP DNA midi (Qiagen). Przygotowanie biblioteki WES przeprowadza się przy użyciu zestawów Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Przechwytywanie eksomu przeprowadza się przy użyciu SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), podczas gdy przygotowanie biblioteki RNAseq odbywa się przy użyciu zestawu TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Sekwencjonowanie przeprowadza się jako sparowane końce 2x150 bp na NovaSeq 6000 (Illumina), uzyskując co najmniej 26 Gb, 18 Gb lub 33 miliony odczytów surowych danych sekwencji odpowiednio dla próbek DNA guza, DNA nienowotworowego lub RNA guza. W celu profilowania molekularnego DNA nowotworu poddaje się wykrywaniu krótkich wariantów somatycznych przy użyciu analizy WES guza/normalnego, wykrywania zmian liczby kopii, statusu TMB i MSI oraz analizy sygnatur mutacji. RNA guza jest wykorzystywane do generowania profilu ekspresji wykorzystywanego jako dane wejściowe do klasyfikacji tkanek26. Ponadto RNAseq umożliwia wykrywanie transkryptów fuzyjnych w celu identyfikacji większych skrótów chromosomalnych. ctDNA jest ekstrahowany z 10 ml próbek krwi lub, w nielicznych przypadkach, z płynu otrzewnowego w probówkach do pobierania krwi bez komórek (Streck) przy użyciu zestawu QiaSymphony Virus/patogen Midi Kit (Qiagen). Do przygotowania biblioteki stosuje się test TruSight Oncology 500 (Illumina). Sekwencjonowanie sparowanych końców 2x150 bp przeprowadza się na NovaSeq 6000 (Illumina), uzyskując minimalne pokrycie 1500x docelowych regionów. Za pomocą DNA nienowotworowego wykrywa się klinicznie istotne warianty patogenne w małym zestawie genów (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT i TP53). Warianty linii zarodkowej w innych genach nie są analizowane, chyba że wyraźnie poproszą genetycy kliniczni i wyrażą na to zgodę pacjent. Surowe dane sekwencjonowania są przetwarzane i przechowywane w regionalnym systemie informatycznym. Dane sekwencjonowania i dodatkowe metadane są przesyłane do Duńskiego Narodowego Centrum Genomu. Wewnętrzna procedura bioinformatyczna jest następująca: Przy użyciu zestawu narzędzi do analizy genomu (GATK) proces jest w dużej mierze zgodny z zaleceniami GATK. Przefiltrowany plik wariantów (VCF) jest przesyłany wraz z informacjami o płci, wieku, rozpoznaniu i wykrytych transkryptach fuzyjnych, stratach lub zyskach genów do Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) w celu automatycznej klasyfikacji wariantów. Wszystkie warianty o znaczeniu klinicznym są ręcznie weryfikowane poprzez wizualną kontrolę danych DNA i RNAseq. Warianty są klasyfikowane jako patogenne, prawdopodobnie patogenne, warianty o nieznanym znaczeniu (VUS) lub łagodne/prawdopodobnie łagodne. QCI jest również używany prospektywnie do łączenia wariantów i zatwierdzonych metod leczenia lub badań klinicznych w poziomy. Warianty nienowotworowe są klasyfikowane zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP z 2015 r. i wraz z historią pacjentów są przeglądane przez lekarza specjalizującego się w genetyce klinicznej. W przypadku zidentyfikowania wariantu linii zarodkowej z prawdopodobnymi konsekwencjami dla zdrowia pacjenta lub jego krewnego, pacjentom, którzy poprosili o tę informację w zgodzie z protokołem, proponuje się skierowanie do Zakładu Genetyki Klinicznej. Raporty generowane są za pomocą dedykowanej platformy (PrOnco) z danych klinicznych zapisanych w REDCap oraz danych wariantów. Platforma umożliwia generowanie raportów dotyczących guzów na żądanie lub udostępnianie ich za pośrednictwem interaktywnego interfejsu.

Przypadki są prezentowane na cotygodniowym internetowym multidyscyplinarnym NTB, kierowanym przez jednostkę fazy I w Rigshospitalet w Kopenhadze. W oparciu o historię i charakterystykę pacjentów, sugerowane są ujawnione warianty molekularne, sygnatury genów lub inne cechy guza oraz dostępne badania lub leki, dopasowane terapie i badania kliniczne wczesnej fazy.

Leczenie może być oferowane na miejscu, jeśli NTB zasugeruje lek celowany o zatwierdzonym w kraju wskazaniu. Jeśli nie, pacjent może być leczony według dostępnego protokołu klinicznego. Obejmuje to w szczególności badanie ProTarget — ogólnokrajowe, zainicjowane przez badaczy badanie koszykowe leczenia ukierunkowanego, badające skuteczność zatwierdzonych leków stosowanych „poza wskazaniami” w kohortach pacjentów z podobnym celem, podobnym lekiem i podobną diagnozą (NCT04341181). Jeśli żaden zatwierdzony lek lub odpowiedni protokół nie jest dostępny lub wykonalny, podejmuje się leczenie lekiem celowanym stosowanym poza protokołem klinicznym. Obejmuje to leczenie lekiem, który jest oznakowany, ale niezatwierdzony przez władze duńskie, jednak może być stosowany po uzyskaniu indywidualnej zgody. Obejmuje to również leczenie „poza wskazaniami” po indywidualnym pozwoleniu lub „stosowanie ze współczuciem” z niezatwierdzonym lekiem w „programie nazwanego użytkownika”. Pacjenci leczeni dopasowanymi lekami celowanymi poza badaniem klinicznym leku są oceniani za pomocą tomografii komputerowej lub rezonansu magnetycznego oraz biomarkerów na początku badania i co 8 lub 9 tygodni aż do wystąpienia progresji. Próbki krwi do badań są pobierane i przechowywane w Bio-and Genome Bank Denmark, podczas gdy dane dotyczące leczenia są rejestrowane prospektywnie.