Proseq Cancer: profilazione genomica in pazienti con cancro incurabile alla ricerca di un trattamento mirato

I pazienti vengono reclutati dalla regione della Danimarca settentrionale. Questo è un programma di medicina di precisione basato sul sequenziamento interno dell'intero esoma (WES) e sul sequenziamento dell'RNA (RNAseq). A tutti i pazienti idonei viene offerta l'iscrizione a un protocollo approvato, che consente il biobancaggio, la registrazione dei dati clinici e di laboratorio e la condivisione dei dati genomici a scopo di ricerca, rispettando al contempo i requisiti del GDPR danese.

Dopo il consenso informato, i dati clinico-patologici al basale vengono registrati dagli investigatori oncologici. I risultati di nuove valutazioni patologiche e molecolari vengono registrati in modo prospettico così come le decisioni prese presso il National Molecular Tumor Board (NTB).

Nuove biopsie con ago centrale da 1,2 mm vengono prelevate dalla lesione tumorale più facilmente accessibile, preferibilmente in progressione che non è stata irradiata, solitamente guidate da ultrasuoni. Le biopsie da lesioni polmonari localizzate centralmente o da altri siti con aumentato rischio di complicanze o procedure che richiedono l'anestesia generale sono generalmente evitate. In ogni caso, una biopsia viene fissata in formalina tamponata neutra e assegnata alla valutazione istopatologica. Altre 1-2 biopsie adiacenti vengono mantenute in RNA successivamente fino all'elaborazione per l'analisi molecolare entro 5 giorni. I pazienti con tumori intracranici vengono sottoposti a biopsia al momento della chirurgia diagnostica o se è altrimenti richiesto un intervento chirurgico e il tessuto viene mantenuto congelato a -80 ° C fino a quando il decorso clinico indica che i pazienti sono idonei per il protocollo. Parallelamente, viene prelevato un campione di sangue EDTA da 10 ml per l'analisi del DNA non tumorale. È preferibile materiale tissutale non fissato o fresco congelato. Tuttavia, in pazienti selezionati per i quali non è possibile ottenere una nuova biopsia e non è disponibile tessuto congelato fresco, il DNA viene estratto dal campione di tessuto tumorale archiviato FFPE più recente. Il DNA tumorale libero da cellule (ctDNA) da campioni di sangue periferico viene utilizzato nei casi con tessuto insufficiente per l'analisi. I campioni per l'analisi del ctDNA vengono raccolti in provette per la raccolta del sangue di DNA privo di cellule (Streck).

Le biopsie tumorali FFPE vengono tagliate in quattro sezioni di 4 µm e una di 1 µm. Una sezione di 4 µm è colorata con ematossilina ed eosina e un'altra con anticorpo HER2. Il cancro e il sottotipo istologico sono diagnosticati da patologi consulenti senior. Ulteriori analisi patologiche, tra cui immunoistochimica o NGS mirato, vengono eseguite su tessuto FFPE su iniziativa del patologo o se richiesto dagli investigatori o dal comitato dei tumori.

Il profilo molecolare viene eseguito internamente, ma può essere eseguito anche in altri siti. La procedura interna è la seguente: le biopsie tissutali in tessuto RNAlater o fresco congelato vengono omogeneizzate e l'RNA e il DNA vengono estratti utilizzando Qiagen AllPrep®. Il DNA non tumorale per la profilazione viene estratto dai leucociti del sangue periferico utilizzando il kit QiaSymphony DSP DNA midi (Qiagen). La preparazione della libreria WES viene eseguita utilizzando i kit di preparazione della libreria Sureselect XT HS (Agilent). L'acquisizione dell'esoma viene eseguita utilizzando SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), mentre la preparazione della libreria RNAseq viene eseguita utilizzando il TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Il sequenziamento viene eseguito come paired-end 2x150 bp su un NovaSeq 6000 (Illumina), producendo rispettivamente un minimo di 26 Gb, 18 Gb o 33 milioni di letture di dati di sequenza non elaborati per campioni di DNA tumorale, DNA non tumorale o RNA tumorale. Per la profilazione molecolare, il DNA tumorale è sottoposto a rilevamento di varianti somatiche brevi mediante analisi WES tumorale/normale, rilevamento di alterazioni del numero di copie, stato TMB e MSI e analisi della firma mutazionale. L'RNA tumorale viene utilizzato per la generazione di un profilo di espressione utilizzato come input per la classificazione dei tessuti26. Inoltre, RNAseq consente il rilevamento di trascritti di fusione per l'identificazione di abbreviazioni cromosomiche più grandi. Il ctDNA viene estratto da 10 ml di campioni di sangue o, in alcuni casi, dal fluido peritoneale in provette per la raccolta del sangue con DNA privo di cellule (Streck) utilizzando il QiaSymphony Virus/patogeno Midi Kit (Qiagen). Il saggio TruSight Oncology 500 (Illumina) viene utilizzato per la preparazione delle librerie. Il sequenziamento paired-end 2x150 bp viene eseguito su un NovaSeq 6000 (Illumina) producendo una copertura minima di 1500x delle regioni mirate. Utilizzando il DNA non tumorale, le varianti patogene clinicamente rilevanti vengono rilevate in un piccolo set di geni (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT e TP53). Le varianti della linea germinale in altri geni non vengono analizzate, a meno che non sia specificamente richiesto dai genetisti clinici e acconsentito dal paziente. I dati grezzi di sequenziamento vengono elaborati e archiviati nel sistema informatico regionale. I dati di sequenziamento e i metadati supplementari vengono inviati al Danish National Genome Center. La procedura bioinformatica interna è la seguente: Utilizzando il Genome Analysis Tool Kit (GATK), il processo segue in gran parte le raccomandazioni del GATK. Il file delle varianti filtrate (VCF) viene caricato insieme alle informazioni su sesso, età, diagnosi e trascrizioni di fusione rilevate, perdite o guadagni genici, in Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) per la classificazione automatica delle varianti. Tutte le varianti di rilevanza clinica vengono verificate manualmente mediante ispezione visiva dei dati DNA e RNAseq. Le varianti sono classificate come patogene, probabilmente patogene, varianti di significato sconosciuto (VUS) o benigne/probabilmente benigne. QCI viene anche utilizzato in modo prospettico per collegare varianti e trattamenti approvati o studi clinici in livelli. Le varianti non tumorali sono classificate secondo le linee guida ACMG/AMP 2015 e sono, insieme alla storia dei pazienti, esaminate da un medico specializzato in genetica clinica. Se viene identificata una variante della linea germinale con una probabile conseguenza per la salute del paziente o di un parente, ai pazienti che avevano richiesto queste informazioni al consenso del protocollo viene offerto l'invio al Dipartimento di Genetica Clinica. I report vengono generati utilizzando una piattaforma dedicata (PrOnco) dai dati clinici archiviati in REDCap e dai dati delle varianti. La piattaforma consente di generare un report on demand o di renderlo accessibile tramite un'interfaccia interattiva.

I casi vengono presentati in un NTB multidisciplinare settimanale basato sul web, diretto dall'unità di fase I del Rigshospitalet, Copenaghen. Sulla base della storia e delle caratteristiche dei pazienti, delle varianti molecolari rivelate, delle firme geniche o di altre caratteristiche tumorali e degli studi o farmaci disponibili, vengono suggeriti trattamenti abbinati e studi clinici in fase iniziale.

Il trattamento può essere offerto in loco se l'NTB suggerisce un farmaco mirato con un'indicazione approvata a livello nazionale. In caso contrario, il paziente può essere trattato secondo un protocollo clinico disponibile. Ciò include in particolare lo studio ProTarget, un basket trial a livello nazionale avviato dallo sperimentatore sul trattamento mirato, che studia l'efficacia dei farmaci approvati usati "off label" in coorti di pazienti con un target simile, un farmaco simile e una diagnosi simile (NCT04341181). Se non è disponibile o fattibile alcun farmaco approvato o protocollo pertinente, viene perseguito il trattamento con un farmaco mirato utilizzato al di fuori di un protocollo clinico. Ciò include il trattamento con un farmaco etichettato ma non approvato dalle autorità danesi, tuttavia, può essere utilizzato previa autorizzazione individuale. Include anche il trattamento "off label" dopo il permesso individuale o "l'uso compassionevole" con un farmaco non approvato in un "programma per utente designato". I pazienti trattati con farmaci mirati abbinati al di fuori di uno studio clinico sui farmaci vengono valutati mediante scansioni TC o RM e biomarcatori al basale e ogni 8 o 9 settimane fino alla progressione. I campioni di sangue per la ricerca vengono prelevati e conservati presso la Bio-and Genome Bank Denmark, mentre i dati relativi al trattamento vengono registrati prospetticamente.