Proseq Cancer: Perfil genômico em pacientes com câncer incurável em busca de tratamento direcionado

Os pacientes são recrutados na região norte da Dinamarca. Este é um programa de medicina de precisão baseado no sequenciamento interno de exoma inteiro (WES) e sequenciamento de RNA (RNAseq). Todos os pacientes elegíveis recebem inscrição em um protocolo aprovado, que permite biobancos, registro de dados clínicos e laboratoriais e compartilhamento de dados genômicos com o objetivo de pesquisa, cumprindo os requisitos dinamarqueses do GDPR.

Após o consentimento informado, os dados de base clínico-patológicos são registrados por investigadores oncológicos. Os resultados de novas avaliações patológicas e moleculares são registrados prospectivamente, bem como as decisões tomadas no National Molecular Tumor Board (NTB).

Novas biópsias com agulha grossa de 1,2 mm são retiradas da lesão tumoral mais facilmente acessível, de preferência em progressão, que não tenha sido irradiada, geralmente guiadas por ultrassom. Biópsias de lesões pulmonares localizadas centralmente ou outros locais com risco aumentado de complicações, ou procedimentos que requerem anestesia geral são geralmente evitadas. Em cada caso, uma biópsia é fixada em formalina tamponada neutra e alocada para avaliação histopatológica. Outras 1-2 biópsias adjacentes são mantidas em RNA mais tarde até o processamento para análise molecular em 5 dias. Pacientes com tumores intracranianos são biopsiados no momento da cirurgia diagnóstica ou se a cirurgia for necessária, e o tecido é mantido congelado a -80°C até que o curso clínico indique que os pacientes são elegíveis para o protocolo. Paralelamente, uma amostra de sangue de 10 ml de EDTA é coletada para análise de DNA não tumoral. O material de tecido não fixado ou fresco congelado é o preferido. No entanto, em pacientes selecionados para os quais uma nova biópsia não pode ser obtida e nenhum tecido fresco congelado está disponível, o DNA é extraído da amostra de arquivo FFPE mais recente de tecido tumoral. O DNA tumoral livre de células (ctDNA) de amostras de sangue periférico é usado em casos com tecido insuficiente para análise. As amostras para análise de ctDNA são coletadas em tubos de coleta de sangue de DNA livre de células (Streck).

As biópsias de tumor FFPE são cortadas em quatro seções de 4 µm e uma de 1 µm. Uma seção de 4 µm é corada com hematoxilina e eosina e outra com anticorpo HER2. O câncer e o subtipo histológico são diagnosticados por patologistas consultores seniores. Análises patológicas adicionais, incluindo imuno-histoquímica ou NGS direcionado, são feitas no tecido FFPE por iniciativa do patologista ou se solicitado pelos investigadores ou pelo conselho de tumores.

O perfil molecular é realizado internamente, mas também pode ser realizado em outros locais. O procedimento interno é o seguinte: As biópsias de tecido em RNAlater ou tecido fresco congelado são homogeneizadas e o RNA e o DNA são extraídos usando Qiagen AllPrep®. O DNA não tumoral para criação de perfil é extraído de leucócitos do sangue periférico usando o kit QiaSymphony DSP DNA midi (Qiagen). A preparação da biblioteca WES é realizada usando os kits de preparação de bibliotecas Sureselect XT HS (Agilent). A captura do exoma é realizada usando o SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), enquanto a preparação da biblioteca de RNAseq é feita usando o TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). O sequenciamento é realizado como 2x150 bp paired-end em um NovaSeq 6000 (Illumina), produzindo no mínimo 26 Gb, 18 Gb ou 33 milhões de leituras de dados brutos de sequência para DNA tumoral, DNA não tumoral ou amostras de RNA tumoral, respectivamente. Para o perfil molecular, o DNA do tumor é submetido à detecção de variantes curtas somáticas usando análise WES tumoral/normal, detecção de alterações no número de cópias, status de TMB e MSI e análise de assinatura mutacional. O RNA tumoral é utilizado para a geração de um perfil de expressão utilizado como entrada para classificação tecidual26. Além disso, o RNAseq permite a detecção de transcrições de fusão para identificação de abreviaturas cromossômicas maiores. O ctDNA é extraído de amostras de sangue de 10 ml ou, em alguns casos, de fluido peritoneal em tubos de coleta de sangue de DNA livre de células (Streck) usando QiaSymphony Virus/pathogen Midi Kit (Qiagen). O ensaio TruSight Oncology 500 (Illumina) é utilizado para a preparação da biblioteca. O sequenciamento pareado de 2x150 pb é realizado em um NovaSeq 6000 (Illumina) produzindo uma cobertura mínima de 1500x das regiões alvo. Usando o DNA não tumoral, variantes patogênicas clinicamente relevantes são detectadas em um pequeno conjunto de genes (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT e TP53). Variantes germinativas em outros genes não são analisadas, a menos que especificamente solicitado por geneticistas clínicos e consentido pelo paciente. Os dados brutos de sequenciamento são processados ​​e armazenados no sistema regional de TI. Dados de sequenciamento e metadados suplementares são enviados ao Centro Nacional de Genoma da Dinamarca. O procedimento bioinformático interno é o seguinte: Usando o Genome Analysis Tool Kit (GATK), o processo segue em grande parte as recomendações do GATK. O arquivo variante filtrado (VCF) é carregado junto com informações sobre sexo, idade, diagnóstico e transcrições de fusão detectadas, perdas ou ganhos de genes, para o Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) para classificação automática de variantes. Todas as variantes de significado clínico são verificadas manualmente por inspeção visual dos dados de DNA e RNAseq. As variantes são classificadas como patogênicas, provavelmente patogênicas, variantes de significado desconhecido (VUS) ou benignas/provavelmente benignas. O QCI também é usado prospectivamente para vincular variantes e tratamentos aprovados ou ensaios clínicos em níveis. As variantes não tumorais são classificadas de acordo com as diretrizes ACMG/AMP 2015 e são, juntamente com o histórico dos pacientes, revisadas por um médico especialista em genética clínica. Se for identificada uma variante germinativa com uma provável consequência para a saúde do paciente ou de um familiar, os pacientes que solicitaram essa informação no consentimento do protocolo são encaminhados para o Departamento de Genética Clínica. Os relatórios são gerados usando uma plataforma dedicada (PrOnco) a partir de dados clínicos armazenados no REDCap e dados de variantes. A plataforma permite que um relatório do tumor board seja gerado sob demanda ou disponibilizado por meio de uma interface interativa.

Os casos são apresentados semanalmente em um NTB multidisciplinar baseado na web, dirigido pela unidade de fase I do Rigshospitalet, Copenhague. Com base no histórico e nas características dos pacientes, variantes moleculares divulgadas, assinaturas de genes ou outras características do tumor e ensaios ou medicamentos disponíveis, são sugeridos tratamentos combinados e ensaios clínicos em fase inicial.

O tratamento pode ser oferecido no local se um medicamento direcionado de indicação aprovada nacionalmente for sugerido pelo NTB. Caso contrário, o paciente pode ser tratado em um protocolo clínico disponível. Isso inclui especialmente o estudo ProTarget - um estudo nacional iniciado por investigadores de tratamento direcionado, que estuda a eficácia de medicamentos aprovados usados ​​"off label" em coortes de pacientes com um alvo semelhante, medicamento semelhante e diagnóstico semelhante (NCT04341181). Se nenhum medicamento aprovado ou protocolo relevante estiver disponível ou viável, o tratamento com um medicamento direcionado usado fora de um protocolo clínico é buscado. Isso inclui o tratamento com um medicamento rotulado, mas não aprovado pelas autoridades dinamarquesas; no entanto, pode ser usado após permissão individual. Também inclui tratamento "off label" após permissão individual ou "uso compassivo" com um medicamento não aprovado em um "programa de usuário nomeado". Os pacientes tratados com medicamentos direcionados combinados fora de um ensaio clínico de medicamentos são avaliados por tomografia computadorizada ou ressonância magnética e biomarcadores no início e a cada 8 ou 9 semanas até a progressão. Amostras de sangue para pesquisa são coletadas e armazenadas no Bio-and Genome Bank Denmark, enquanto os dados de tratamento são registrados prospectivamente.