Proseq Cancer : profilage génomique chez les patients atteints d'un cancer incurable à la recherche d'un traitement ciblé

Les patients sont recrutés dans la région du Danemark du Nord. Il s'agit d'un programme de médecine de précision basé sur le séquençage interne de l'exome entier (WES) et le séquençage de l'ARN (RNAseq). Tous les patients éligibles se voient proposer une inscription dans un protocole approuvé, qui permet la biobanque, l'enregistrement des données cliniques et de laboratoire et le partage des données génomiques à des fins de recherche, tout en respectant les exigences danoises du RGPD.

Après consentement éclairé, les données de base clinico-pathologiques sont enregistrées par les enquêteurs oncologiques. Les résultats des nouvelles évaluations pathologiques et moléculaires sont enregistrés de manière prospective ainsi que les décisions prises au Conseil national des tumeurs moléculaires (NTB).

De nouvelles biopsies à l'aiguille centrale de 1,2 mm sont prélevées sur la lésion tumorale la plus facilement accessible, de préférence en progression et non irradiée, généralement guidée par échographie. Les biopsies de lésions pulmonaires situées au centre ou d'autres sites présentant un risque accru de complications, ou les procédures nécessitant une anesthésie générale sont généralement évitées. Dans chaque cas, une biopsie est fixée dans du formol tamponné neutre et attribuée au bilan histopathologique. 1 à 2 autres biopsies adjacentes sont conservées dans RNAlater jusqu'au traitement pour l'analyse moléculaire dans les 5 jours. Les patients atteints de tumeurs intracrâniennes sont biopsiés au moment de la chirurgie diagnostique ou si une intervention chirurgicale est autrement nécessaire, et les tissus sont conservés congelés à -80 °C jusqu'à ce que l'évolution clinique indique que les patients sont éligibles pour le protocole. En parallèle, un échantillon de sang EDTA de 10 ml est prélevé pour analyse d'ADN non tumoral. Le matériau tissulaire non fixé ou frais congelé est préféré. Cependant, chez certains patients pour lesquels une nouvelle biopsie est impossible à obtenir et aucun tissu frais congelé n'est disponible, l'ADN est extrait de l'échantillon d'archives FFPE le plus récent de tissu tumoral. L'ADN tumoral acellulaire (ctDNA) provenant d'échantillons de sang périphérique est utilisé dans les cas où le tissu est insuffisant pour l'analyse. Les échantillons pour l'analyse de l'ADNct sont prélevés dans des tubes de prélèvement sanguin d'ADN sans cellule (Streck).

Les biopsies tumorales FFPE sont découpées en quatre coupes de 4 µm et une de 1 µm. Une section de 4 µm est colorée avec de l'hématoxyline et de l'éosine et une autre avec l'anticorps HER2. Le cancer et le sous-type histologique sont diagnostiqués par des pathologistes consultants seniors. Des analyses pathologiques supplémentaires, y compris l'immunohistochimie ou le NGS ciblé, sont effectuées sur le tissu FFPE à l'initiative du pathologiste, ou à la demande des investigateurs ou du tumor board.

Le profilage moléculaire est effectué en interne, mais peut également être effectué sur d'autres sites. La procédure interne est la suivante : les biopsies tissulaires dans de l'ARNlater ou du tissu frais congelé sont homogénéisées, et l'ARN et l'ADN sont extraits à l'aide de Qiagen AllPrep®. L'ADN non tumoral pour le profilage est extrait des leucocytes du sang périphérique à l'aide du kit QiaSymphony DSP DNA midi (Qiagen). La préparation de la bibliothèque WES est effectuée à l'aide des kits de préparation de bibliothèque Sureselect XT HS (Agilent). La capture d'exome est effectuée à l'aide du SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), tandis que la préparation de la bibliothèque RNAseq est effectuée à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ARNm Stranded TruSeq (Illumina). Le séquençage est effectué en tant qu'extrémité appariée de 2x150 bp sur un NovaSeq 6000 (Illumina), produisant un minimum de 26 Gb, 18 Gb ou 33 millions de lectures de données de séquence brutes pour les échantillons d'ADN tumoral, d'ADN non tumoral ou d'ARN tumoral, respectivement. Pour le profilage moléculaire, l'ADN tumoral est soumis à une détection de variante somatique courte à l'aide d'une analyse WES tumorale/normale, d'une détection des modifications du nombre de copies, du statut TMB et MSI et d'une analyse des signatures mutationnelles. L'ARN tumoral est utilisé pour la génération d'un profil d'expression utilisé comme entrée pour la classification des tissus26. De plus, RNAseq permet la détection de transcrits de fusion pour l'identification d'abréviations chromosomiques plus grandes. L'ADNct est extrait d'échantillons de sang de 10 ml ou, dans quelques cas, du liquide péritonéal dans des tubes de prélèvement sanguin d'ADN sans cellules (Streck) à l'aide du kit QiaSymphony Virus/pathogen Midi (Qiagen). Le test TruSight Oncology 500 (Illumina) est utilisé pour la préparation de bibliothèques. Un séquençage apparié de 2x150 bp est effectué sur un NovaSeq 6000 (Illumina) produisant une couverture minimale de 1500x des régions ciblées. En utilisant l'ADN non tumoral, des variants pathogènes cliniquement pertinents sont détectés dans un petit ensemble de gènes (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT et TP53). Les variants germinaux d'autres gènes ne sont pas analysés, sauf sur demande spécifique des généticiens cliniques et avec l'accord du patient. Les données brutes de séquençage sont traitées et stockées dans le système informatique régional. Les données de séquençage et les métadonnées supplémentaires sont soumises au Centre national de génomique danois. La procédure bioinformatique interne est la suivante : à l'aide du kit d'outils d'analyse du génome (GATK), le processus suit en grande partie les recommandations de GATK. Le fichier de variantes filtrées (VCF) est téléchargé avec des informations sur le sexe, l'âge, le diagnostic et les transcriptions de fusion détectées, les pertes ou les gains de gènes, vers Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) pour la classification automatique des variantes. Toutes les variantes d'importance clinique sont vérifiées manuellement par inspection visuelle des données d'ADN et d'ARNseq. Les variantes sont classées comme pathogènes, probablement pathogènes, variantes de signification inconnue (VUS) ou bénignes/probablement bénignes. Le QCI est également utilisé de manière prospective pour relier les variantes et les traitements approuvés ou les essais cliniques en niveaux. Les variantes non tumorales sont classées selon les directives ACMG/AMP 2015 et sont, avec les antécédents des patients, examinées par un médecin spécialisé en génétique clinique. Si une variante germinale avec une conséquence probable pour la santé du patient ou d'un proche est identifiée, les patients qui avaient demandé cette information au moment du consentement au protocole se voient proposer une orientation vers le service de génétique clinique. Les rapports sont générés à l'aide d'une plateforme dédiée (PrOnco) à partir des données cliniques stockées dans REDCap et des données de variantes. La plateforme permet de générer à la demande un rapport de tumor board ou de le rendre accessible via une interface interactive.

Les cas sont présentés lors d'un NTB multidisciplinaire hebdomadaire sur le Web, dirigé par l'unité de phase I du Rigshospitalet, à Copenhague. Sur la base des antécédents et des caractéristiques des patients, des variantes moléculaires divulguées, des signatures génétiques ou d'autres caractéristiques tumorales et des essais ou médicaments disponibles, des traitements appariés et des essais cliniques de phase précoce sont suggérés.

Le traitement peut être proposé sur place si un médicament ciblé d'une indication approuvée au niveau national est suggéré par le NTB. Sinon, le patient peut être traité selon un protocole clinique disponible. Cela inclut en particulier l'essai ProTarget - un essai national de traitement ciblé initié par l'investigateur, étudiant l'efficacité des médicaments approuvés utilisés "hors AMM" dans des cohortes de patients ayant une cible similaire, un médicament similaire et un diagnostic similaire (NCT04341181). Si aucun médicament approuvé ou protocole pertinent n'est disponible ou réalisable, un traitement avec un médicament ciblé utilisé en dehors d'un protocole clinique est poursuivi. Cela inclut le traitement avec un médicament qui est étiqueté mais non approuvé par les autorités danoises, mais qui peut être utilisé après autorisation individuelle. Cela inclut également un traitement "hors AMM" après autorisation individuelle, ou "usage compassionnel" avec un médicament non approuvé dans un "programme d'utilisateurs nommés". Les patients traités avec des médicaments ciblés appariés en dehors d'un essai clinique de médicament sont évalués par tomodensitométrie ou IRM et biomarqueurs au départ et toutes les 8 ou 9 semaines jusqu'à progression. Des échantillons de sang pour la recherche sont prélevés et stockés dans Bio-and Genome Bank Danemark, tandis que les données de traitement sont enregistrées de manière prospective.