Proseq-kanker: genomische profilering bij patiënten met ongeneeslijke kanker op zoek naar gerichte behandeling

Patiënten worden geworven uit de regio Noord-Denemarken. Dit is een programma voor precisiegeneeskunde op basis van in-house whole exome sequencing (WES) en RNA-sequencing (RNAseq). Alle in aanmerking komende patiënten krijgen inschrijving aangeboden in een goedgekeurd protocol, dat biobanking, registratie van klinische en laboratoriumgegevens en het delen van genomische gegevens met het oog op onderzoek mogelijk maakt, terwijl wordt voldaan aan de Deense AVG-vereisten.

Na geïnformeerde toestemming worden klinisch-pathologische basisgegevens geregistreerd door oncologische onderzoekers. Resultaten van nieuwe pathologische en moleculaire beoordelingen worden prospectief geregistreerd, evenals beslissingen die worden genomen door de National Molecular Tumor Board (NTB).

Nieuwe 1,2 mm kernnaaldbiopten worden genomen van de meest gemakkelijk toegankelijke, bij voorkeur voortschrijdende tumorlaesie die niet is bestraald, meestal geleid door echografie. Biopsieën van centraal gelegen longlaesies of andere plaatsen met een verhoogd risico op complicaties, of procedures die algehele anesthesie vereisen, worden over het algemeen vermeden. In elk geval wordt één biopsie gefixeerd in neutraal gebufferde formaline en toegewezen aan histopathologische beoordeling. Een andere, aangrenzende 1-2 biopten worden in RNAlater bewaard tot verwerking voor moleculaire analyse binnen 5 dagen. Bij patiënten met intracraniale tumoren wordt een biopsie genomen op het moment van diagnostische chirurgie of als een operatie anderszins vereist is, en het weefsel wordt bevroren gehouden bij -80°C totdat het klinisch beloop aangeeft dat patiënten in aanmerking komen voor het protocol. Tegelijkertijd wordt een EDTA-bloedmonster van 10 ml afgenomen voor analyse van niet-tumoraal DNA. Niet-gefixeerd of vers ingevroren weefselmateriaal heeft de voorkeur. Bij geselecteerde patiënten voor wie een nieuwe biopsie niet mogelijk is en geen vers ingevroren weefsel beschikbaar is, wordt DNA geëxtraheerd uit het meest recente FFPE-archiefmonster van tumorweefsel. Celvrij tumor-DNA (ctDNA) uit perifere bloedmonsters wordt gebruikt in gevallen met onvoldoende weefsel voor analyse. Monsters voor ctDNA-analyse worden verzameld in celvrije DNA-bloedafnamebuisjes (Streck).

De FFPE-tumorbiopten worden in vier secties van 4 µm en één van 1 µm gesneden. Eén sectie van 4 µm wordt gekleurd met hematoxyline en eosine en een andere met HER2-antilichaam. De kanker en het histologische subtype worden gediagnosticeerd door senior consultant pathologen. Aanvullende pathologische analyses, waaronder immunohistochemie of gerichte NGS, worden uitgevoerd op FFPE-weefsel op initiatief van de patholoog, of op verzoek van onderzoekers of de tumorcommissie.

De moleculaire profilering wordt in eigen beheer uitgevoerd, maar kan ook op andere locaties worden uitgevoerd. De interne procedure is als volgt: Weefselbiopten in RNAlater of vers ingevroren weefsel worden gehomogeniseerd en RNA en DNA worden geëxtraheerd met behulp van Qiagen AllPrep®. Niet-tumoraal DNA voor profilering wordt geëxtraheerd uit perifere bloedleukocyten met behulp van de QiaSymphony DSP DNA midi-kit (Qiagen). WES-bibliotheekvoorbereiding wordt uitgevoerd met behulp van de Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Exome-opname wordt uitgevoerd met behulp van de SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), terwijl de voorbereiding van de RNAseq-bibliotheek wordt uitgevoerd met behulp van de TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Sequentiebepaling wordt uitgevoerd als 2x150 bp gepaarde uiteinden op een NovaSeq 6000 (Illumina), waarbij minimaal 26 Gb, 18 Gb of 33 miljoen aflezingen van ruwe sequentiegegevens worden geproduceerd voor respectievelijk tumor-DNA, niet-tumoraal DNA of tumor-RNA-monsters. Voor moleculaire profilering wordt het tumor-DNA onderworpen aan detectie van somatische korte varianten met behulp van tumor/normale WES-analyse, detectie van kopie-aantalveranderingen, TMB- en MSI-status en analyse van de mutatiesignatuur. Tumor-RNA wordt gebruikt voor het genereren van een expressieprofiel dat wordt gebruikt als input voor weefselclassificatie26. Bovendien maakt RNAseq detectie van fusietranscripten mogelijk voor identificatie van grotere chromosomale afkortingen. ctDNA wordt geëxtraheerd uit bloedmonsters van 10 ml of, in enkele gevallen, uit peritoneale vloeistof in celvrije DNA-bloedafnamebuisjes (Streck) met behulp van QiaSymphony Virus/pathogen Midi Kit (Qiagen). TruSight Oncology 500-assay (Illumina) wordt gebruikt voor bibliotheekvoorbereiding. 2x150 bp paired-end sequencing wordt uitgevoerd op een NovaSeq 6000 (Illumina) die minimaal 1500x dekking van de beoogde regio's produceert. Met behulp van het niet-tumorale DNA worden klinisch relevante pathogene varianten gedetecteerd in een kleine set genen (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT en TP53). Kiembaanvarianten in andere genen worden niet geanalyseerd, tenzij specifiek gevraagd door klinisch genetici en toestemming van de patiënt. Ruwe sequencinggegevens worden verwerkt en opgeslagen onder het regionale IT-systeem. Sequentiegegevens en aanvullende metadata worden ingediend bij het Deense Nationale Genome Centrum. De eigen bioinformatica procedure is als volgt: Met behulp van de Genome Analysis Tool Kit (GATK) volgt het proces grotendeels de GATK-aanbevelingen. Het gefilterde variantbestand (VCF) wordt samen met informatie over geslacht, leeftijd, diagnose en gedetecteerde fusietranscripten, verlies of winst van genen geüpload naar Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) voor automatische classificatie van varianten. Alle varianten van klinisch belang worden handmatig geverifieerd door visuele inspectie van de DNA- en RNAseq-gegevens. Varianten worden geclassificeerd als pathogeen, waarschijnlijk pathogeen, varianten van onbekende betekenis (VUS) of goedaardig/waarschijnlijk goedaardig. QCI wordt ook prospectief gebruikt om varianten en goedgekeurde behandelingen of klinische onderzoeken in lagen te koppelen. Niet-tumorale varianten worden geclassificeerd volgens de ACMG/AMP-richtlijnen van 2015 en worden, samen met de geschiedenis van patiënten, beoordeeld door een arts die gespecialiseerd is in klinische genetica. Als een kiembaanvariant met een waarschijnlijk gevolg voor de gezondheid van de patiënt of een familielid wordt geïdentificeerd, wordt patiënten die bij protocol toestemming om deze informatie hadden gevraagd, verwezen naar de afdeling Klinische Genetica. Rapporten worden gegenereerd met behulp van een speciaal platform (PrOnco) op basis van klinische gegevens die zijn opgeslagen in REDCap en variantgegevens. Het platform maakt het mogelijk om op verzoek een tumorboardrapport te genereren of toegankelijk te maken via een interactieve interface.

Cases worden gepresenteerd op een wekelijkse webgebaseerde multidisciplinaire NTB, geleid door de fase I-eenheid van Rigshospitalet, Kopenhagen. Gebaseerd op de geschiedenis en kenmerken van de patiënt, worden onthulde moleculaire varianten, gensignaturen of andere tumorkenmerken en beschikbare onderzoeken of geneesmiddelen, gematchte behandelingen en klinische onderzoeken in een vroege fase voorgesteld.

Behandeling kan ter plaatse worden aangeboden als een gericht geneesmiddel met een landelijk goedgekeurde indicatie wordt voorgesteld door de NTB. Als dit niet het geval is, kan de patiënt worden behandeld volgens een beschikbaar klinisch protocol. Dit omvat met name de ProTarget-studie - een landelijke, door een onderzoeker geïnitieerde basket-trial van gerichte behandeling, waarbij de werkzaamheid wordt bestudeerd van goedgekeurde geneesmiddelen die "off-label" worden gebruikt in cohorten van patiënten met een vergelijkbaar doelwit, vergelijkbaar medicijn en vergelijkbare diagnose (NCT04341181). Als er geen goedgekeurd medicijn of relevant protocol beschikbaar of haalbaar is, wordt behandeling met een gericht medicijn dat buiten een klinisch protocol wordt gebruikt, voortgezet. Dit geldt ook voor de behandeling met een geneesmiddel dat is geëtiketteerd maar niet is goedgekeurd door de Deense autoriteiten, maar dat wel mag worden gebruikt na individuele toestemming. Het omvat ook "off-label" behandeling na individuele toestemming, of "compassionate use" met een niet-goedgekeurd medicijn in een "named user-programma". Patiënten die worden behandeld met gematchte gerichte geneesmiddelen buiten een klinische geneesmiddelenstudie, worden geëvalueerd door middel van CT- of MR-scans en biomarkers bij aanvang en elke 8e of 9e week tot progressie. Bloedmonsters voor onderzoek worden afgenomen en opgeslagen in de Bio- en Genome Bank Denemarken, terwijl behandelingsgegevens prospectief worden geregistreerd.