Proseq Cancer: perfiles genómicos en pacientes con cáncer incurable en busca de un tratamiento dirigido

Los pacientes se reclutan de la región del norte de Dinamarca. Este es un programa de medicina de precisión basado en la secuenciación interna del exoma completo (WES) y la secuenciación del ARN (RNAseq). A todos los pacientes elegibles se les ofrece la inscripción en un protocolo aprobado, que permite el biobanco, el registro de datos clínicos y de laboratorio, y el intercambio de datos genómicos con fines de investigación, mientras se cumplen los requisitos del RGPD danés.

Después del consentimiento informado, los investigadores oncológicos registran los datos de referencia clínico-patológicos. Los resultados de nuevas evaluaciones patológicas y moleculares se registran prospectivamente, así como las decisiones tomadas en la Junta Nacional de Tumores Moleculares (NTB).

Se toman nuevas biopsias con aguja gruesa de 1,2 mm de la lesión tumoral más fácilmente accesible, preferiblemente en progresión, que no ha sido irradiada, generalmente guiada por ultrasonido. Por lo general, se evitan las biopsias de lesiones pulmonares de ubicación central u otros sitios con mayor riesgo de complicaciones, o los procedimientos que requieren anestesia general. En cada caso, se fija una biopsia en formalina tamponada neutra y se asigna a evaluación histopatológica. Otras 1 o 2 biopsias adyacentes se conservan en RNAlater hasta que se procesan para el análisis molecular en un plazo de 5 días. A los pacientes con tumores intracraneales se les realiza una biopsia en el momento de la cirugía de diagnóstico o si se requiere cirugía de otro modo, y el tejido se mantiene congelado a -80 °C hasta que el curso clínico indica que los pacientes son elegibles para el protocolo. Paralelamente, se extrae una muestra de sangre con EDTA de 10 ml para el análisis de ADN no tumoral. Se prefiere material tisular no fijado o congelado fresco. Sin embargo, en pacientes seleccionados para los que no se puede obtener una nueva biopsia y no hay tejido fresco congelado disponible, el ADN se extrae de la muestra de archivo FFPE más reciente de tejido tumoral. El ADN tumoral libre de células (ctDNA) de muestras de sangre periférica se utiliza en casos con tejido insuficiente para el análisis. Las muestras para el análisis de ctDNA se recolectan en tubos de recolección de sangre de ADN libre de células (Streck).

Las biopsias de tumor FFPE se cortan en cuatro secciones de 4 µm y una de 1 µm. Una sección de 4 µm se tiñe con hematoxilina y eosina y otra con anticuerpo HER2. El cáncer y el subtipo histológico son diagnosticados por patólogos consultores senior. Los análisis patológicos adicionales, incluida la inmunohistoquímica o la NGS dirigida, se realizan en tejido FFPE por iniciativa del patólogo, o si lo solicitan los investigadores o la junta de tumores.

El perfil molecular se realiza internamente, pero también se puede realizar en otros sitios. El procedimiento interno es el siguiente: las biopsias de tejido en RNAlater o tejido fresco congelado se homogeneizan y el ARN y el ADN se extraen con Qiagen AllPrep®. El ADN no tumoral para el perfilado se extrae de leucocitos de sangre periférica utilizando el kit midi de ADN QiaSymphony DSP (Qiagen). La preparación de bibliotecas WES se realiza con los kits de preparación de bibliotecas Sureselect XT HS (Agilent). La captura del exoma se realiza con SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), mientras que la preparación de la biblioteca de RNAseq se realiza con el TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). La secuenciación se lleva a cabo como un extremo emparejado de 2x150 pb en un NovaSeq 6000 (Illumina), que produce un mínimo de 26 Gb, 18 Gb o 33 millones de lecturas de datos de secuencia sin procesar para muestras de ADN tumoral, ADN no tumoral o ARN tumoral, respectivamente. Para el perfil molecular, el ADN del tumor se somete a detección de variantes cortas somáticas mediante análisis WES de tumor/normal, detección de alteraciones del número de copias, estado de TMB y MSI, y análisis de firma mutacional. El ARN tumoral se utiliza para la generación de un perfil de expresión utilizado como entrada para la clasificación de tejidos26. Además, RNAseq permite la detección de transcripciones de fusión para la identificación de abreviaturas cromosómicas más grandes. El ctDNA se extrae de muestras de sangre de 10 ml o, en algunos casos, del líquido peritoneal en tubos de extracción de sangre de ADN libre de células (Streck) utilizando el kit QiaSymphony Virus/pathogen Midi (Qiagen). El ensayo TruSight Oncology 500 (Illumina) se utiliza para la preparación de bibliotecas. La secuenciación de extremos emparejados de 2x150 pb se realiza en un NovaSeq 6000 (Illumina) que produce una cobertura mínima de 1500x de las regiones seleccionadas. Utilizando el ADN no tumoral, se detectan variantes patogénicas clínicamente relevantes en un pequeño conjunto de genes (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT y TP53). Las variantes de la línea germinal en otros genes no se analizan, a menos que los genetistas clínicos lo soliciten específicamente y el paciente lo autorice. Los datos de secuenciación sin procesar se procesan y almacenan en el sistema de TI regional. Los datos de secuenciación y los metadatos complementarios se envían al Centro Nacional del Genoma de Dinamarca. El procedimiento bioinformático interno es el siguiente: Utilizando el kit de herramientas de análisis del genoma (GATK), el proceso sigue en gran medida las recomendaciones de GATK. El archivo de variante filtrada (VCF) se carga junto con información sobre sexo, edad, diagnóstico y transcripciones de fusión detectadas, pérdidas o ganancias de genes, a Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) para la clasificación automática de variantes. Todas las variantes de importancia clínica se verifican manualmente mediante inspección visual de los datos de ADN y RNAseq. Las variantes se clasifican como patógenas, probablemente patógenas, variantes de significado desconocido (VUS) o benignas/probablemente benignas. QCI también se usa prospectivamente para vincular variantes y tratamientos aprobados o ensayos clínicos en niveles. Las variantes no tumorales se clasifican según las guías ACMG/AMP de 2015 y son revisadas, junto con la historia de los pacientes, por un médico especialista en genética clínica. Si se identifica una variante de la línea germinal con una probable consecuencia para la salud del paciente o de un familiar, se ofrece derivación al Departamento de Genética Clínica a los pacientes que solicitaron esta información en el consentimiento del protocolo. Los informes se generan utilizando una plataforma dedicada (PrOnco) a partir de datos clínicos almacenados en REDCap y datos de variantes. La plataforma permite generar un informe de la junta de tumores a pedido o hacerlo accesible a través de una interfaz interactiva.

Los casos se presentan en un NTB multidisciplinario semanal basado en la web, dirigido por la unidad de fase I en Rigshospitalet, Copenhague. Según el historial y las características de los pacientes, se sugieren variantes moleculares reveladas, firmas genéticas u otras características tumorales y ensayos o fármacos disponibles, tratamientos combinados y ensayos clínicos en fase temprana.

El tratamiento se puede ofrecer en el sitio si la NTB sugiere un medicamento dirigido de una indicación aprobada a nivel nacional. Si no, el paciente puede ser tratado en un protocolo clínico disponible. Esto incluye especialmente el ensayo ProTarget, un ensayo combinado de tratamiento dirigido a nivel nacional iniciado por un investigador, que estudia la eficacia de los medicamentos aprobados que se usan "fuera de etiqueta" en cohortes de pacientes con un objetivo similar, un fármaco similar y un diagnóstico similar (NCT04341181). Si no hay ningún fármaco aprobado o protocolo relevante disponible o factible, se busca el tratamiento con un fármaco dirigido utilizado fuera de un protocolo clínico. Esto incluye el tratamiento con un medicamento que está etiquetado pero no aprobado por las autoridades danesas; sin embargo, puede usarse después de un permiso individual. También incluye el tratamiento "fuera de etiqueta" después del permiso individual, o el "uso compasivo" con un medicamento no aprobado en un "programa de usuario designado". Los pacientes tratados con medicamentos dirigidos coincidentes fuera de un ensayo clínico de medicamentos se evalúan mediante tomografías computarizadas o resonancias magnéticas y biomarcadores al inicio y cada 8 o 9 semanas hasta la progresión. Las muestras de sangre para la investigación se extraen y almacenan en Bio-and Genome Bank Dinamarca, mientras que los datos de tratamiento se registran de forma prospectiva.