Proseq Cancer: Genomisk profilering hos patienter med uhelbredelig cancer på jagt efter målrettet behandling

Patienter rekrutteres fra Region Nordjylland. Dette er et præcisionsmedicinprogram baseret på intern hel exome-sekventering (WES) og RNA-sekventering (RNAseq). Alle berettigede patienter tilbydes optagelse i en godkendt protokol, som giver mulighed for biobanking, registrering af kliniske og laboratoriedata samt deling af genomiske data med henblik på forskning, samtidig med at de danske GDPR-krav opfyldes.

Efter informeret samtykke registreres klinisk-patologiske baselinedata af onkologiske efterforskere. Resultater af nye patologiske og molekylære vurderinger registreres prospektivt samt beslutninger truffet i National Molecular Tumor Board (NTB).

Nye 1,2 mm kernenålebiopsier tages fra den lettest tilgængelige, fortrinsvis fremadskridende tumorlæsion, som ikke er blevet bestrålet, normalt styret af ultralyd. Biopsier fra centralt placerede lungelæsioner eller andre steder med øget risiko for komplikationer eller procedurer, der kræver generel anæstesi, undgås generelt. I hvert tilfælde fikseres én biopsi i neutral-pufret formalin og allokeres til histopatologisk vurdering. En anden, tilstødende 1-2 biopsier opbevares i RNAlater indtil behandling til molekylær analyse inden for 5 dage. Patienter med intrakranielle tumorer biopsieres på tidspunktet for diagnostisk kirurgi, eller hvis operation på anden måde er påkrævet, og væv opbevares frosset ved -80°C, indtil det kliniske forløb indikerer, at patienterne er berettigede til protokollen. Parallelt hermed udtages en 10 ml EDTA-blodprøve til analyse af ikke-tumoralt DNA. Ufikseret eller frisk frosset tissuemateriale foretrækkes. Hos udvalgte patienter, for hvem en ny biopsi ikke kan opnås, og der ikke er tilgængeligt frisk frosset væv, ekstraheres DNA fra den seneste FFPE-arkivprøve af tumorvæv. Cellefrit tumor-DNA (ctDNA) fra perifere blodprøver anvendes i tilfælde med utilstrækkeligt væv til analyse. Prøver til ctDNA-analyse opsamles i cellefri DNA-blodopsamlingsrør (Streck).

FFPE-tumorbiopsierne skæres i fire sektioner på 4 µm og en på 1 µm. Et 4 µm snit farves med hæmatoxylin og eosin og et andet med HER2-antistof. Kræften og den histologiske undertype diagnosticeres af seniorkonsulentpatologer. Yderligere patologiske analyser, herunder immunhistokemi eller målrettet NGS, udføres på FFPE-væv på initiativ af patologen, eller efter anmodning fra efterforskere eller tumorstyrelsen.

Den molekylære profilering udføres internt, men kan også udføres på andre steder. Den interne procedure er som følger: Vævsbiopsier i RNAlater eller frisk frosset væv homogeniseres, og RNA og DNA ekstraheres med Qiagen AllPrep®. Ikke-tumoralt DNA til profilering ekstraheres fra perifere blodleukocytter ved hjælp af QiaSymphony DSP DNA midi kit (Qiagen). WES-biblioteksforberedelse udføres ved hjælp af Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Exome capture udføres ved hjælp af SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), mens RNAseq biblioteksforberedelse udføres ved hjælp af TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Sekventering udføres som 2x150 bp parret ende på en NovaSeq 6000 (Illumina), der producerer minimum 26 Gb, 18 Gb eller 33 millioner aflæsninger af rå sekvensdata for henholdsvis tumor-DNA, non-tumoralt DNA eller tumor-RNA-prøver. Til molekylær profilering udsættes tumor-DNA'et for somatisk kort variantdetektion ved anvendelse af tumor/normal WES-analyse, påvisning af kopiantalændringer, TMB- og MSI-status og mutationssignaturanalyse. Tumor-RNA bruges til generering af en ekspressionsprofil, der bruges som input til vævsklassificering26. Desuden muliggør RNAseq påvisning af fusionstranskripter til identifikation af større kromosomale forkortelser. ctDNA ekstraheres fra 10 ml blodprøver eller, i få tilfælde, fra peritonealvæske i cellefri DNA-blodopsamlingsrør (Streck) ved hjælp af QiaSymphony Virus/patogen Midi Kit (Qiagen). TruSight Oncology 500 assay (Illumina) bruges til biblioteksforberedelse. 2x150 bp parret ende-sekventering udføres på en NovaSeq 6000 (Illumina), der producerer minimum 1500x dækning af de målrettede regioner. Ved hjælp af det ikke-tumorale DNA påvises klinisk relevante patogene varianter i et lille sæt gener (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT og TP53). Kimlinjevarianter i andre gener analyseres ikke, medmindre det specifikt anmodes om af kliniske genetikere og samtykke fra patienten. Rå sekventeringsdata behandles og lagres under det regionale IT-system. Sekventeringsdata og supplerende metadata indsendes til Dansk Nationalt Genom Center. Den interne bioinformatiske procedure er som følger: Ved at bruge Genome Analysis Tool Kit (GATK) følger processen stort set GATK-anbefalingerne. Den filtrerede variantfil (VCF) uploades sammen med information om køn, alder, diagnose og påviste fusionstransskriptioner, gentab eller gevinster til Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) for automatisk klassificering af varianter. Alle varianter af klinisk betydning verificeres manuelt ved visuel inspektion af DNA- og RNAseq-data. Varianter klassificeres som patogene, sandsynligt patogene, varianter af ukendt betydning (VUS) eller godartede/sandsynlige benigne. QCI bruges også prospektivt til at sammenkæde varianter og godkendte behandlinger eller kliniske forsøg i niveauer. Ikke-tumorale varianter er klassificeret i henhold til 2015 ACMG/AMP-retningslinjerne og er sammen med patienternes historie gennemgået af en læge med speciale i klinisk genetik. Hvis der identificeres en kimlinjevariant med en sandsynlig konsekvens for patientens eller en pårørendes helbred, tilbydes patienter, der havde anmodet om disse oplysninger ved protokolsamtykke, henvisning til Klinisk Genetikafdeling. Rapporter genereres ved hjælp af en dedikeret platform (Pronco) fra kliniske data gemt i REDCap og variantdata. Platformen gør det muligt at generere en tumortavlerapport efter behov eller gøres tilgængelig via en interaktiv grænseflade.

Cases præsenteres på en ugentlig webbaseret multidisciplinær NTB, ledet af fase I-enheden på Rigshospitalet, København. Baseret på patienternes historie og karakteristika, afslørede molekylære varianter, gensignaturer eller andre tumorkarakteristika og tilgængelige forsøg eller lægemidler, foreslås matchede behandlinger og tidlige kliniske forsøg.

Behandling kan tilbydes på stedet, hvis et målrettet lægemiddel af en nationalt godkendt indikation foreslås af NTB. Hvis ikke, kan patienten blive behandlet i en tilgængelig klinisk protokol. Dette omfatter især ProTarget-studiet - et landsdækkende, investigator-initieret kurvforsøg med målrettet behandling, der studerer effektiviteten af ​​godkendte lægemidler, der anvendes "off label" i kohorter af patienter med et lignende mål, lignende lægemiddel og lignende diagnose (NCT04341181). Hvis intet godkendt lægemiddel eller relevant protokol er tilgængelig eller gennemførlig, fortsættes behandling med et målrettet lægemiddel, der anvendes uden for en klinisk protokol. Dette omfatter behandling med et lægemiddel, der er mærket, men ikke godkendt af de danske myndigheder, dog kan anvendes efter individuel tilladelse. Det inkluderer også "off label"-behandling efter individuel tilladelse eller "medfølende brug" med et ikke-godkendt lægemiddel i et "navngivet brugerprogram". Patienter behandlet med matchede målrettede lægemidler uden for et klinisk lægemiddelforsøg evalueres ved CT- eller MR-scanninger og biomarkører ved baseline og hver 8. eller 9. uge indtil progression. Blodprøver til forskning udtages og opbevares i Bio- og Genom Bank Danmark, mens behandlingsdata registreres prospektivt.