Proseq-Krebs: Genomisches Profiling bei Patienten mit unheilbarem Krebs auf der Suche nach einer gezielten Behandlung

Die Patienten werden aus der Region Norddänemark rekrutiert. Dies ist ein Programm für Präzisionsmedizin, das auf der internen Sequenzierung des gesamten Exoms (WES) und der RNA-Sequenzierung (RNAseq) basiert. Allen berechtigten Patienten wird die Aufnahme in ein genehmigtes Protokoll angeboten, das Biobanking, die Registrierung klinischer und Labordaten und den Austausch genomischer Daten zu Forschungszwecken ermöglicht und gleichzeitig die dänischen DSGVO-Anforderungen erfüllt.

Nach informierter Zustimmung werden klinisch-pathologische Basisdaten von onkologischen Prüfärzten registriert. Ergebnisse neuer pathologischer und molekularer Untersuchungen werden prospektiv registriert sowie Entscheidungen im National Molecular Tumor Board (NTB) getroffen.

Neue 1,2-mm-Stanzbiopsien werden aus der am besten zugänglichen, vorzugsweise fortschreitenden Tumorläsion, die nicht bestrahlt wurde, normalerweise unter Ultraschallkontrolle, entnommen. Biopsien aus zentral gelegenen Lungenläsionen oder anderen Stellen mit erhöhtem Komplikationsrisiko oder Eingriffe, die eine Vollnarkose erfordern, werden im Allgemeinen vermieden. Jeweils eine Biopsie wird in neutral gepuffertem Formalin fixiert und der histopathologischen Beurteilung zugeordnet. Weitere, benachbarte 1–2 Biopsien werden in RNAlater aufbewahrt, bis sie für die molekulare Analyse innerhalb von 5 Tagen verarbeitet werden. Patienten mit intrakraniellen Tumoren werden zum Zeitpunkt der diagnostischen Operation biopsiert oder wenn eine Operation anderweitig erforderlich ist, und das Gewebe wird bei -80 °C eingefroren, bis der klinische Verlauf anzeigt, dass die Patienten für das Protokoll geeignet sind. Parallel dazu wird eine 10 ml EDTA-Blutprobe zur Analyse von Nicht-Tumor-DNA entnommen. Unfixiertes oder frisch gefrorenes Gewebematerial wird bevorzugt. Bei ausgewählten Patienten, für die keine neue Biopsie erhältlich ist und kein frisches gefrorenes Gewebe verfügbar ist, wird die DNA jedoch aus der neuesten FFPE-Archivprobe von Tumorgewebe extrahiert. Zellfreie Tumor-DNA (ctDNA) aus peripheren Blutproben wird in Fällen verwendet, in denen nicht genügend Gewebe für die Analyse vorhanden ist. Proben für die ctDNA-Analyse werden in zellfreien DNA-Blutentnahmeröhrchen (Streck) gesammelt.

Die FFPE-Tumorbiopsien werden in vier Abschnitte von 4 &mgr;m und einen von 1 &mgr;m geschnitten. Ein 4-µm-Schnitt wird mit Hämatoxylin und Eosin und ein weiterer mit HER2-Antikörper gefärbt. Der Krebs und der histologische Subtyp werden von leitenden Pathologen diagnostiziert. Zusätzliche pathologische Analysen, einschließlich Immunhistochemie oder zielgerichteter NGS, werden auf Initiative des Pathologen oder auf Anfrage von Prüfärzten oder dem Tumorboard an FFPE-Gewebe durchgeführt.

Das molekulare Profiling wird intern durchgeführt, kann aber auch an anderen Standorten durchgeführt werden. Das interne Verfahren ist wie folgt: Gewebebiopsien in RNAlater oder frisch gefrorenes Gewebe werden homogenisiert und RNA und DNA werden mit Qiagen AllPrep® extrahiert. Nicht-Tumor-DNA für die Profilerstellung wird mit dem QiaSymphony DSP DNA Midi Kit (Qiagen) aus peripheren Blutleukozyten extrahiert. Die Vorbereitung der WES-Bibliothek erfolgt mit den Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Die Exomerfassung wird mit SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent) durchgeführt, während die Vorbereitung der RNAseq-Bibliothek mit dem TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina) erfolgt. Die Sequenzierung wird als 2x150 bp Paired-End auf einem NovaSeq 6000 (Illumina) durchgeführt, was mindestens 26 Gb, 18 Gb oder 33 Millionen Reads von Rohsequenzdaten für Tumor-DNA-, Nicht-Tumor-DNA- bzw. Tumor-RNA-Proben erzeugt. Zur molekularen Profilerstellung wird die Tumor-DNA dem Nachweis somatischer Kurzvarianten unter Verwendung einer Tumor/normalen WES-Analyse, dem Nachweis von Änderungen der Kopienzahl, dem TMB- und MSI-Status und der Mutationssignaturanalyse unterzogen. Tumor-RNA wird zur Erstellung eines Expressionsprofils verwendet, das als Eingabe für die Gewebeklassifizierung verwendet wird26. Darüber hinaus ermöglicht RNAseq den Nachweis von Fusionstranskripten zur Identifizierung größerer chromosomaler Abkürzungen. ctDNA wird aus 10-ml-Blutproben oder in wenigen Fällen aus Peritonealflüssigkeit in zellfreien DNA-Blutentnahmeröhrchen (Streck) mit dem QiaSymphony Virus/Pathogen Midi Kit (Qiagen) extrahiert. TruSight Oncology 500 Assay (Illumina) wird für die Bibliotheksvorbereitung verwendet. Paired-End-Sequenzierung mit 2 x 150 bp wird auf einem NovaSeq 6000 (Illumina) durchgeführt, wodurch eine mindestens 1500-fache Abdeckung der Zielregionen erzielt wird. Unter Verwendung der Nicht-Tumor-DNA werden klinisch relevante pathogene Varianten in einer kleinen Gruppe von Genen (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT und TP53). Keimbahnvarianten in anderen Genen werden nicht analysiert, es sei denn, dies wird ausdrücklich von klinischen Genetikern angefordert und der Patient hat zugestimmt. Rohe Sequenzierungsdaten werden verarbeitet und unter dem regionalen IT-System gespeichert. Sequenzdaten und ergänzende Metadaten werden an das Dänische Nationale Genomzentrum übermittelt. Das hausinterne bioinformatische Verfahren ist wie folgt: Unter Verwendung des Genome Analysis Tool Kit (GATK) folgt der Prozess weitgehend den GATK-Empfehlungen. Die gefilterte Variantendatei (VCF) wird zusammen mit Informationen zu Geschlecht, Alter, Diagnose und nachgewiesenen Fusionstranskripten, Genverlusten oder -gewinnen zur automatischen Klassifizierung von Varianten in Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) hochgeladen. Alle Varianten von klinischer Bedeutung werden manuell durch visuelle Inspektion der DNA- und RNAseq-Daten verifiziert. Varianten werden als pathogen, wahrscheinlich pathogen, Varianten unbekannter Signifikanz (VUS) oder gutartig/wahrscheinlich gutartig klassifiziert. QCI wird auch prospektiv verwendet, um Varianten und zugelassene Behandlungen oder klinische Studien in Ebenen zu verknüpfen. Nicht-tumorale Varianten werden gemäß den ACMG/AMP-Richtlinien von 2015 klassifiziert und zusammen mit der Anamnese der Patienten von einem auf klinische Genetik spezialisierten Arzt überprüft. Wenn eine Keimbahnvariante mit wahrscheinlichen Folgen für die Gesundheit des Patienten oder eines Angehörigen identifiziert wird, wird Patienten, die diese Informationen bei der Protokolleinwilligung angefordert hatten, eine Überweisung an die Abteilung für Klinische Genetik angeboten. Berichte werden mithilfe einer dedizierten Plattform (PrOnco) aus in REDCap gespeicherten klinischen Daten und Variantendaten generiert. Die Plattform ermöglicht es, einen Tumorboard-Bericht auf Abruf zu erstellen oder über eine interaktive Schnittstelle zugänglich zu machen.

Die Fälle werden bei einem wöchentlichen webbasierten multidisziplinären NTB vorgestellt, das von der Phase-I-Einheit des Rigshospitalet, Kopenhagen, geleitet wird. Basierend auf der Krankengeschichte und den Merkmalen der Patienten, offengelegten molekularen Varianten, Gensignaturen oder anderen Tumormerkmalen und verfügbaren Studien oder Medikamenten werden abgestimmte Behandlungen und klinische Studien in der Frühphase vorgeschlagen.

Die Behandlung kann vor Ort angeboten werden, wenn ein zielgerichtetes Medikament mit national zugelassener Indikation vom NTB vorgeschlagen wird. Wenn nicht, kann der Patient in einem verfügbaren klinischen Protokoll behandelt werden. Dazu gehört insbesondere die ProTarget-Studie – eine landesweite, Prüfer-initiierte Basket-Studie zur zielgerichteten Behandlung, die die Wirksamkeit von zugelassenen Arzneimitteln untersucht, die „off-label“ in Kohorten von Patienten mit einem ähnlichen Ziel, einem ähnlichen Medikament und einer ähnlichen Diagnose verwendet werden (NCT04341181). Wenn kein zugelassenes Medikament oder relevantes Protokoll verfügbar oder machbar ist, wird die Behandlung mit einem zielgerichteten Medikament, das außerhalb eines klinischen Protokolls verwendet wird, fortgesetzt. Dies schließt die Behandlung mit einem Arzneimittel ein, das gekennzeichnet, aber von den dänischen Behörden nicht zugelassen ist, jedoch nach individueller Genehmigung verwendet werden darf. Es umfasst auch eine „Off-Label“-Behandlung nach individueller Genehmigung oder „Compassionate Use“ mit einem nicht zugelassenen Medikament in einem „Named-User-Programm“. Patienten, die außerhalb einer klinischen Arzneimittelstudie mit abgestimmten zielgerichteten Arzneimitteln behandelt werden, werden zu Studienbeginn und alle 8 oder 9 Wochen bis zur Progression durch CT- oder MR-Scans und Biomarker untersucht. Blutproben für Forschungszwecke werden entnommen und in der Bio- und Genombank Dänemark aufbewahrt, während Behandlungsdaten prospektiv registriert werden.