Proseq Cancer: Genomikus profilalkotás gyógyíthatatlan rákos betegeknél a célzott kezelés után

A betegeket az észak-dániai régióból toborozzák. Ez egy precíziós orvosi program, amely házon belüli teljes exome szekvenáláson (WES) és RNS szekvenáláson (RNAseq) alapul. Minden jogosult betegnek felajánljuk, hogy beiratkozzon egy jóváhagyott protokollba, amely lehetővé teszi a biobankolást, a klinikai és laboratóriumi adatok regisztrálását, valamint a genomikai adatok kutatási célú megosztását, miközben teljesíti a dán GDPR követelményeit.

A tájékozott beleegyezés után a klinikai-patológiai alapadatokat onkológiai kutatók regisztrálják. Az új patológiai és molekuláris vizsgálatok eredményeit prospektívan regisztrálják, valamint az Országos Molekuláris Tumor Testület (NTB) döntéseit.

A legkönnyebben hozzáférhető, lehetőleg előrehaladó, nem besugárzott daganatos lézióból új 1,2 mm-es mag tűbiopsziát vesznek, általában ultrahang vezérelve. A központilag elhelyezkedő tüdőléziókból vagy más, a szövődmények fokozott kockázatával járó helyekről származó biopsziák, illetve az általános érzéstelenítést igénylő eljárások általában kerülendők. Minden esetben egy biopsziát rögzítünk semleges pufferolt formalinban, és szövettani vizsgálathoz rendeljük. Egy másik, szomszédos 1-2 biopsziát az RNAlaterben tárolunk, amíg 5 napon belül fel nem dolgozzák a molekuláris analízishez. Az intracranialis daganatos betegeknél biopsziát vesznek a diagnosztikai műtét idején, vagy ha egyébként műtétre van szükség, és a szöveteket -80 °C-on lefagyasztják, amíg a klinikai lefolyás azt jelzi, hogy a betegek jogosultak a protokollra. Ezzel párhuzamosan 10 ml EDTA vérmintát veszünk a nem tumoros DNS elemzéséhez. Előnyben részesítjük a nem rögzített vagy frissen fagyasztott szövetanyagot. Azonban azoknál a kiválasztott betegeknél, akiknél új biopszia nem érhető el, és nem áll rendelkezésre friss fagyasztott szövet, a DNS-t a tumorszövet legutóbbi FFPE archív mintájából vonják ki. A perifériás vérmintákból származó sejtmentes tumor-DNS-t (ctDNS-t) használnak olyan esetekben, amikor nincs elegendő szövet az elemzéshez. A ctDNS analízishez szükséges mintákat sejtmentes DNS-vérgyűjtő csövekben (Streck) gyűjtjük.

Az FFPE tumorbiopsziákat négy 4 µm-es és egy 1 µm-es részre vágjuk. Egy 4 µm-es metszetet hematoxilinnel és eozinnal, egy másikat HER2-antitesttel festünk. A rákot és a szövettani altípust vezető patológus szaktanácsadó diagnosztizálja. A patológus kezdeményezésére, vagy a vizsgálók vagy a tumorbizottság kérésére további patológiai elemzéseket végeznek az FFPE-szöveten, beleértve az immunhisztokémiát vagy a célzott NGS-t.

A molekuláris profilalkotást házon belül végzik, de más helyeken is elvégezhető. A házon belüli eljárás a következő: Az RNAlater-ben vagy frissen fagyasztott szövetben vett szövetbiopsziákat homogenizálják, és az RNS-t és a DNS-t Qiagen AllPrep® segítségével extrahálják. A profilalkotáshoz szükséges nem tumoros DNS-t QiaSymphony DSP DNS midi kit (Qiagen) segítségével vonják ki a perifériás vér leukocitáiból. A WES könyvtár előkészítése a Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent) segítségével történik. Az exome rögzítése a SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent) segítségével, míg az RNAseq könyvtár előkészítése a TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina) segítségével történik. A szekvenálást 2x150 bp-os páros végként végzik egy NovaSeq 6000-en (Illumina), amely legalább 26 Gb, 18 Gb vagy 33 millió leolvasott nyers szekvencia adatot állít elő tumor DNS-hez, nem-tumorális DNS-hez vagy tumor RNS-mintákhoz. A molekuláris profilalkotáshoz a tumor DNS-t szomatikus rövid variáns kimutatásnak vetik alá tumor/normál WES analízissel, a kópiaszám változásainak kimutatásával, a TMB és MSI státuszával és a mutációs aláírás elemzésével. A tumor RNS-t egy expressziós profil létrehozására használják, amelyet a szövetek osztályozásának bemeneteként használnak26. Ezenkívül az RNAseq lehetővé teszi a fúziós transzkriptumok kimutatását a nagyobb kromoszómális rövidítések azonosítása érdekében. A ctDNS-t 10 ml-es vérmintákból, illetve néhány esetben hashártyafolyadékból vonják ki sejtmentes DNS-vérvételi csövekben (Streck) QiaSymphony Virus/pathogen Midi Kit (Qiagen) segítségével. A TruSight Oncology 500 tesztet (Illumina) használják a könyvtár előkészítésére. A 2x150 bp-os páros végű szekvenálást NovaSeq 6000-en (Illumina) végezzük, amely legalább 1500-szoros lefedettséget biztosít a megcélzott régiókban. A nem-tumorális DNS segítségével klinikailag releváns patogén variánsokat detektálunk egy kis génkészletben (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT és TP53). Más gének csíravonal-variánsait nem elemezzük, kivéve, ha a klinikai genetikusok kifejezetten kérik és a beteg beleegyezik. A nyers szekvenálási adatok feldolgozása és tárolása a regionális informatikai rendszerben történik. A szekvenálási adatokat és a kiegészítő metaadatokat a Dán Nemzeti Genomközponthoz kell benyújtani. A házon belüli bioinformatikai eljárás a következő: Genome Analysis Tool Kit (GATK) segítségével a folyamat nagyrészt követi a GATK ajánlásait. A szűrt variánsfájl (VCF) a nemre, életkorra, diagnózisra és az észlelt fúziós átiratokra, génvesztésekre vagy -gyarapodásokra vonatkozó információkkal együtt feltöltődik a Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) szolgáltatásba a változatok automatikus osztályozása érdekében. Minden klinikai jelentőségű változatot manuálisan ellenőriznek a DNS és az RNAseq adatok vizuális ellenőrzésével. A változatok patogén, valószínű patogén, ismeretlen jelentőségű változatok (VUS) vagy jóindulatú/valószínűleg jóindulatúak. A QCI-t prospektíven is használják a változatok és jóváhagyott kezelések vagy klinikai vizsgálatok rétegekbe történő összekapcsolására. A nem tumoros változatokat a 2015-ös ACMG/AMP irányelvek szerint osztályozzák, és a betegek történetével együtt egy klinikai genetikára szakosodott orvos vizsgálja felül. Ha olyan csíravonal-variánst azonosítanak, amely a beteg vagy hozzátartozója egészségére nézve valószínűsíthetően kihatással van, a betegeknek, akik a protokoll beleegyezésével kérték ezt az információt, felajánlják, hogy beutalják a Klinikai Genetikai Osztályra. A jelentések egy dedikált platformon (PrOnco) készülnek a REDCap-ban tárolt klinikai adatokból és a változatok adataiból. A platform lehetővé teszi a tumortábla-jelentés igény szerinti előállítását vagy interaktív interfészen keresztül elérhetővé tételét.

Az eseteket heti rendszerességgel, webalapú multidiszciplináris NTB-n mutatják be, amelyet a koppenhágai Rigshospitalet I. fázisú egysége irányít. A betegek kórtörténete és jellemzői, közzétett molekuláris variánsai, génaláírásai vagy egyéb tumorjellemzői, valamint a rendelkezésre álló vizsgálatok vagy gyógyszerek, megfelelő kezelések és korai fázisú klinikai vizsgálatok alapján javasoltak.

A kezelést a helyszínen lehet felajánlani, ha az NTB országosan engedélyezett indikációjú célzott gyógyszert javasol. Ha nem, a beteg egy rendelkezésre álló klinikai protokoll szerint kezelhető. Ez különösen magában foglalja a ProTarget-próbát – egy országos, kutatók által kezdeményezett, célzott kezelést célzó kosárpróbát, amely a jóváhagyott, „megjelölésen kívül” alkalmazott gyógyszerek hatékonyságát vizsgálja hasonló célponttal, hasonló gyógyszerrel és hasonló diagnózissal rendelkező betegek csoportjaiban (NCT04341181). Ha nem áll rendelkezésre jóváhagyott gyógyszer vagy megfelelő protokoll, akkor a kezelést a klinikai protokollon kívül használt célzott gyógyszerrel folytatják. Ez magában foglalja a dán hatóságok által felcímkézett, de a dán hatóságok által nem engedélyezett gyógyszerrel történő kezelést is, azonban egyéni engedélyt követően használható. Tartalmazza továbbá az egyéni engedélyt követő "megjelölésen kívüli" kezelést vagy a "megnevezett felhasználói programban" nem jóváhagyott gyógyszerrel történő "együttérzéses használatát". A klinikai gyógyszervizsgálaton kívül megfelelő célzott gyógyszerekkel kezelt betegeket CT- vagy MR-vizsgálatokkal és biomarkerekkel értékelik kiinduláskor, majd minden 8. vagy 9. héten a progresszióig. A kutatáshoz szükséges vérmintákat a Bio-and Genome Bank Denmarkban veszik és tárolják, míg a kezelési adatokat prospektíven regisztrálják.