Proseq Cancer: Genomické profilování u pacientů s nevyléčitelnou rakovinou při hledání cílené léčby

Pacienti se rekrutují z regionu Severní Dánsko. Jedná se o program precizní medicíny založený na interním sekvenování celého exomu (WES) a sekvenování RNA (RNAseq). Všem způsobilým pacientům je nabídnuta registrace do schváleného protokolu, který umožňuje biobanking, registraci klinických a laboratorních dat a sdílení genomických dat za účelem výzkumu, a to při splnění dánských požadavků GDPR.

Po informovaném souhlasu jsou klinicko-patologické výchozí údaje registrovány onkologickými zkoušejícími. Výsledky nových patologických a molekulárních hodnocení jsou prospektivně registrovány, stejně jako rozhodnutí přijatá v Národní radě pro molekulární nádory (NTB).

Nové biopsie jádrové jehly o průměru 1,2 mm se odebírají z nejsnáze dostupné, nejlépe progredující nádorové léze, která nebyla ozářena, obvykle řízená ultrazvukem. Biopsie z centrálně lokalizovaných plicních lézí nebo jiných míst se zvýšeným rizikem komplikací nebo procedurám vyžadujícím celkovou anestezii se obecně vyhýbají. V každém případě je jedna biopsie fixována v neutrálně pufrovaném formalínu a přidělena k histopatologickému hodnocení. Další, sousední 1-2 biopsie jsou uchovávány v RNAlater až do zpracování pro molekulární analýzu během 5 dnů. Pacientům s intrakraniálními nádory se provede biopsie v době diagnostického chirurgického zákroku, nebo pokud je chirurgický zákrok jinak vyžadován, a tkáň se udržuje zmrazená při -80 °C, dokud klinický průběh neukáže, že pacienti jsou způsobilí pro protokol. Paralelně se odebírá 10 ml EDTA krevní vzorek pro analýzu nenádorové DNA. Výhodný je nefixovaný nebo čerstvě zmrazený tkáňový materiál. Avšak u vybraných pacientů, u kterých není možné získat novou biopsii a není k dispozici žádná čerstvá zmrazená tkáň, je DNA extrahována z nejnovějšího archivního vzorku nádorové tkáně z FFPE. Bezbuněčná tumorová DNA (ctDNA) ze vzorků periferní krve se používá v případech s nedostatkem tkáně pro analýzu. Vzorky pro analýzu ctDNA se odebírají do bezbuněčných zkumavek pro odběr krve DNA (Streck).

Biopsie nádoru FFPE se nařežou na čtyři řezy 4 um a jeden 1 um. Jeden 4 um řez je obarven hematoxylinem a eosinem a druhý HER2-protilátkou. Rakovina a histologický podtyp jsou diagnostikovány staršími konzultanty patologů. Další patologické analýzy, včetně imunohistochemie nebo cílené NGS, se provádějí na tkáni FFPE z iniciativy patologa nebo na žádost vyšetřovatelů nebo rady pro nádory.

Molekulární profilování se provádí interně, ale může být také provedeno na jiných místech. Vlastní postup je následující: Tkáňové biopsie v RNA pozdější nebo čerstvé zmrazené tkáni se homogenizují a RNA a DNA se extrahují pomocí Qiagen AllPrep®. Nenádorová DNA pro profilování je extrahována z leukocytů periferní krve pomocí QiaSymphony DSP DNA midi kit (Qiagen). Příprava WES knihovny se provádí pomocí Sureselect XT HS Library Prep Kits (Agilent). Zachycení exomu se provádí pomocí SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), zatímco příprava knihovny RNAseq se provádí pomocí TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Sekvenování se provádí jako párový konec 2x150 bp na NovaSeq 6000 (Illumina), čímž se získá minimálně 26 Gb, 18 Gb nebo 33 milionů čtení nezpracovaných sekvenčních dat pro vzorky nádorové DNA, nenádorové DNA nebo nádorové RNA. Pro molekulární profilování je nádorová DNA podrobena somatické krátké variantní detekci pomocí nádorové/normální WES analýzy, detekce změn počtu kopií, stavu TMB a MSI a analýzy signatur mutací. Nádorová RNA se používá pro vytvoření expresního profilu používaného jako vstup pro klasifikaci tkání26. Navíc RNAseq umožňuje detekci fúzních transkriptů pro identifikaci větších chromozomálních zkratek. ctDNA se extrahuje z 10 ml vzorků krve nebo v několika případech z peritoneální tekutiny v bezbuněčných zkumavkách pro odběr krve DNA (Streck) pomocí QiaSymphony Virus/patogen Midi Kit (Qiagen). Pro přípravu knihovny se používá test TruSight Oncology 500 (Illumina). Sekvenování párových konců 2x150 bp se provádí na NovaSeq 6000 (Illumina) poskytující minimálně 1500x pokrytí cílových oblastí. Pomocí nenádorové DNA jsou detekovány klinicky relevantní patogenní varianty v malém souboru genů (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT a TP53). Zárodečné varianty v jiných genech nejsou analyzovány, pokud to klinickí genetici výslovně nepožadují a nesouhlasí pacient. Nezpracovaná sekvenační data jsou zpracovávána a ukládána v rámci regionálního IT systému. Sekvenační data a doplňková metadata se předkládají Dánskému národnímu genomovému centru. Interní bioinformatický postup je následující: Pomocí sady nástrojů pro analýzu genomu (GATK) se proces z velké části řídí doporučeními GATK. Filtrovaný soubor variant (VCF) je nahrán spolu s informacemi o pohlaví, věku, diagnóze a detekovaných fúzních transkriptech, ztrátách nebo přírůstcích genů do Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) pro automatickou klasifikaci variant. Všechny varianty klinického významu jsou ručně ověřovány vizuální kontrolou dat DNA a RNAseq. Varianty jsou klasifikovány jako patogenní, pravděpodobně patogenní, varianty neznámého významu (VUS) nebo benigní/pravděpodobně benigní. QCI se také prospektivně používá k propojení variant a schválených léčebných postupů nebo klinických studií do vrstev. Nenádorové varianty jsou klasifikovány podle doporučení ACMG/AMP z roku 2015 a jsou spolu s anamnézou pacientů přezkoumávány MD specializovaným na klinickou genetiku. Pokud je identifikována zárodečná varianta s pravděpodobným důsledkem pro zdraví pacienta nebo příbuzného, ​​je pacientům, kteří si tuto informaci vyžádali při souhlasu s protokolem, nabídnuto doporučení na oddělení klinické genetiky. Zprávy jsou generovány pomocí vyhrazené platformy (PrOnco) z klinických dat uložených v REDCap a dat variant. Tato platforma umožňuje generování zprávy o nádorové desce na vyžádání nebo její zpřístupnění prostřednictvím interaktivního rozhraní.

Případy jsou prezentovány na týdenním webovém multidisciplinárním NTB řízeném jednotkou fáze I v Rigshospitalet v Kodani. Na základě anamnézy a charakteristik pacientů jsou navrženy odhalené molekulární varianty, genové podpisy nebo jiné charakteristiky nádoru a dostupné studie nebo léky, odpovídající léčby a klinické studie rané fáze.

Léčba může být nabídnuta na místě, pokud NTB navrhne cílený lék s celostátně schválenou indikací. Pokud ne, pacient může být léčen podle dostupného klinického protokolu. To zahrnuje zejména studii ProTarget – celostátní, výzkumnými pracovníky iniciovanou košovou studii cílené léčby, která studuje účinnost schválených léků používaných „off label“ v kohortách pacientů s podobným cílem, podobným lékem a podobnou diagnózou (NCT04341181). Pokud není dostupný nebo proveditelný žádný schválený lék nebo příslušný protokol, pokračuje se v léčbě cíleným lékem používaným mimo klinický protokol. To zahrnuje léčbu lékem, který je označen, ale není schválen dánskými úřady, avšak může být použit po individuálním povolení. Zahrnuje také léčbu „off label“ po individuálním povolení nebo „soucitné užívání“ neschváleného léku v „programu pojmenovaného uživatele“. Pacienti léčení odpovídajícími cílenými léky mimo klinickou studii léků jsou hodnoceni pomocí CT nebo MR skenů a biomarkerů na začátku a každý 8. nebo 9. týden až do progrese. Vzorky krve pro výzkum jsou odebírány a skladovány v Bio- and Genome Bank Denmark, zatímco údaje o léčbě jsou registrovány prospektivně.