Proseq Cancer: геномное профилирование пациентов с неизлечимым раком в поисках таргетного лечения

Пациенты набираются из региона Северная Дания. Это программа точной медицины, основанная на собственном секвенировании всего экзома (WES) и секвенировании РНК (RNAseq). Всем подходящим пациентам предлагается зарегистрироваться в утвержденном протоколе, который позволяет вести биобанк, регистрировать клинические и лабораторные данные и обмениваться геномными данными с целью исследования при соблюдении требований GDPR Дании.

После информированного согласия клинико-патологические исходные данные регистрируются исследователями-онкологами. Проспективно регистрируются результаты новых патологических и молекулярных оценок, а также решения, принимаемые Национальным советом по молекулярным опухолям (NTB).

Новые 1,2-миллиметровые биоптаты с толстой иглой берутся из наиболее легкодоступного, предпочтительно прогрессирующего опухолевого поражения, которое не подвергалось облучению, обычно под контролем УЗИ. Обычно избегают биопсии центрально расположенных поражений легких или других участков с повышенным риском осложнений, а также процедур, требующих общей анестезии. В каждом случае одна биопсия фиксируется в нейтральном забуференном формалине и направляется на гистопатологическую оценку. Другие, соседние 1-2 биопсии хранятся в RNAlater до обработки для молекулярного анализа в течение 5 дней. У пациентов с внутричерепными опухолями берут биопсию во время диагностической операции или, если требуется хирургическое вмешательство, и ткань замораживают при -80°C до тех пор, пока клиническое течение не покажет, что пациенты подходят для протокола. Параллельно берут 10 мл образца крови с ЭДТА для анализа неопухолевой ДНК. Предпочтителен нефиксированный или свежезамороженный тканевый материал. Однако у некоторых пациентов, у которых невозможно получить новую биопсию и нет свежезамороженной ткани, ДНК извлекают из самого последнего архивного образца опухолевой ткани FFPE. Бесклеточная опухолевая ДНК (цтДНК) из образцов периферической крови используется в случаях недостаточности ткани для анализа. Образцы для анализа цДНК собирают в пробирки для сбора бесклеточной ДНК крови (Streck).

Биоптаты опухоли FFPE разрезают на четыре секции по 4 мкм и одну по 1 мкм. Один срез размером 4 мкм окрашивают гематоксилином и эозином, а другой — антителом к ​​HER2. Рак и гистологический подтип диагностируются старшими патологоанатомами-консультантами. Дополнительные патологические анализы, включая иммуногистохимию или целевой NGS, выполняются на ткани FFPE по инициативе патологоанатома или по требованию исследователей или совета по опухолям.

Молекулярное профилирование выполняется внутри компании, но может быть выполнено и в других местах. Внутренняя процедура выглядит следующим образом: биопсии ткани в РНКлатере или свежезамороженной ткани гомогенизируют, а РНК и ДНК выделяют с помощью Qiagen AllPrep®. Неопухолевую ДНК для составления профиля выделяют из лейкоцитов периферической крови с использованием миди-набора QiaSymphony DSP DNA (Qiagen). Подготовка библиотеки WES выполняется с использованием наборов для подготовки библиотеки Sureselect XT HS (Agilent). Захват экзома выполняется с помощью SureSelect XT HS Clinical Research Exome V2 (Agilent), а подготовка библиотеки RNAseq выполняется с использованием набора TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina). Секвенирование проводят как парный конец 2x150 п.н. на NovaSeq 6000 (Illumina), производя минимум 26 Гб, 18 Гб или 33 миллиона прочтений необработанных данных последовательности для образцов ДНК опухоли, неопухолевой ДНК или опухолевой РНК соответственно. Для молекулярного профилирования опухолевая ДНК подвергается обнаружению коротких соматических вариантов с использованием анализа WES опухоль/нормальный, обнаружению изменений числа копий, статусу TMB и MSI и анализу мутационных сигнатур. Опухолевая РНК используется для создания профиля экспрессии, используемого в качестве исходных данных для классификации тканей26. Кроме того, RNAseq позволяет обнаруживать слитые транскрипты для идентификации более крупных хромосомных аббревиатур. ctDNA экстрагируют из 10 мл образцов крови или, в некоторых случаях, из перитонеальной жидкости в пробирки для сбора бесклеточной ДНК крови (Streck) с использованием набора QiaSymphony Virus/pathogen Midi Kit (Qiagen). Анализ TruSight Oncology 500 (Illumina) используется для подготовки библиотеки. Секвенирование парных концов 2x150 п.н. выполняется на NovaSeq 6000 (Illumina), обеспечивая минимальное покрытие целевых областей в 1500 раз. Используя неопухолевую ДНК, клинически значимые патогенные варианты обнаруживаются в небольшом наборе генов (BRCA1, BRCA2, ATM, MLH1, MSH2, MSH3, PMS1, MLH3, MSH6, PMS2, PALB2, RAD51C, RAD51D, MBD4, ANKRD26, CEBPA, DDX41, ETV6, GATA3, RUNX1, TERC, TERT и TP53). Варианты зародышевой линии в других генах не анализируются, за исключением случаев, когда это специально запрошено клиническими генетиками и получено согласие пациента. Необработанные данные секвенирования обрабатываются и хранятся в региональной ИТ-системе. Данные секвенирования и дополнительные метаданные передаются в Датский национальный центр генома. Внутренняя биоинформатическая процедура выглядит следующим образом: Используя набор инструментов для анализа генома (GATK), процесс в значительной степени следует рекомендациям GATK. Файл отфильтрованных вариантов (VCF) загружается вместе с информацией о поле, возрасте, диагнозе и обнаруженных транскриптах слияния, потерях или приобретениях генов в Qiagen Clinical Insight Interpret (QCI) для автоматической классификации вариантов. Все варианты клинической значимости проверяются вручную путем визуального контроля данных ДНК и РНКсек. Варианты классифицируются как патогенные, вероятно патогенные, варианты неизвестного значения (VUS) или доброкачественные/вероятно доброкачественные. QCI также используется проспективно для связывания вариантов и утвержденных методов лечения или клинических испытаний в уровни. Неопухолевые варианты классифицируются в соответствии с рекомендациями ACMG/AMP от 2015 г. и вместе с историей болезни пациентов рассматриваются доктором медицинских наук, специализирующимся на клинической генетике. Если выявляется вариант зародышевой линии с вероятными последствиями для здоровья пациента или его родственника, пациентам, запросившим эту информацию в соответствии с протоколом, предлагается направление в отделение клинической генетики. Отчеты создаются с использованием специальной платформы (PrOnco) на основе клинических данных, хранящихся в REDCap, и данных вариантов. Платформа позволяет генерировать отчет о доске опухолей по запросу или делать его доступным через интерактивный интерфейс.

Случаи представляются на еженедельном междисциплинарном веб-сайте NTB, которым руководит подразделение фазы I в Rigshospitalet, Копенгаген. На основании анамнеза и характеристик пациентов, раскрытых молекулярных вариантов, генных сигнатур или других характеристик опухоли, а также доступных испытаний или лекарств предлагаются соответствующие методы лечения и клинические испытания на ранней стадии.

Лечение может быть предложено на месте, если NTB предложит таргетное лекарство, одобренное на национальном уровне. В противном случае пациент может лечиться в соответствии с доступным клиническим протоколом. Это, в частности, включает исследование ProTarget — общенациональное, инициированное исследователями комплексное исследование таргетного лечения, в котором изучается эффективность одобренных препаратов, используемых «не по назначению» в когортах пациентов с аналогичной мишенью, аналогичным препаратом и аналогичным диагнозом (NCT04341181). Если одобренный препарат или соответствующий протокол недоступны или невозможны, проводится лечение таргетным препаратом, используемым вне клинического протокола. Это включает лечение препаратом, который промаркирован, но не одобрен датскими властями, однако может использоваться после индивидуального разрешения. Это также включает лечение «не по прямому назначению» после индивидуального разрешения или «сострадательное использование» неутвержденного препарата в «программе для именных пользователей». Пациенты, получающие таргетные препараты вне клинических испытаний, оцениваются с помощью КТ- или МРТ-сканирования и биомаркеров на исходном уровне и каждые 8-ю или 9-ю неделю до прогрессирования. Образцы крови для исследований берутся и хранятся в банке био- и геномов Дании, а данные о лечении регистрируются проспективно.